AMPA-receptorer og celledød
Mange sygdomme i hjernen skyldes, at nerveceller dør. En undertype af nervecellernes receptorer for signalstoffet glutaminsyre, AMPA-receptorerne, spiller bl.a. en rolle for nervedød ved epilepsi og blodpropper. Studier af receptorerne kan øge forståelsen af sygdomsprocesserne og identificere mål for nye lægemidler.
Af Jette Bisgaard Jensen og Arne Schousboe
Fra Lægemiddelforskning 1999
Glutaminsyre er hjernens vigtigste stimulerende signalstof og spiller en vigtig rolle i mange fysiologiske processer såsom udvikling af nerveceller, indlæringsprocesser og hukommelse. Imidlertid kan glutaminsyre også være yderst skadelig for nervecellerne. Hvis koncentrationen af signalstoffet bliver for høj omkring en nervecelle, kan cellen tage skade og eventuelt dø.
Den celledød, der ses efter sygdomstilstande som epilepsi og blodpropper, menes at være forårsaget af en overaktivering af receptorerne for glutaminsyre. Derfor er det et vigtigt terapeutisk mål for udvikling af nye lægemidler at kunne hindre celledøden. Det kan f.eks. opnås ved brug af stoffer, der blokerer receptorerne. En anden mulighed er at standse de processer, som foregår inde i cellerne, når receptorerne er blevet aktiveret.
Flere receptorer for glutaminsyre
Receptorer er betegnelsen for specifikke proteiner i cellemembranen, som signalstofferne binder sig til. Ved binding af et signalstof til receptoren, sker der nogle ændringer inde i cellerne, som afhænger af receptorens art.
I hjernen findes der flere forskellige typer receptorer for glutaminsyre, og tre af dem har fået navn efter stoffer, som aktiverer dem. Receptorerne kaldes for NMDA-, AMPA- og kainsyrereceptorer. Ved udviklingen af nye lægemidler til behandling af nervedød forårsaget af glutaminsyre, er det vigtigt at kende de enkelte receptorers indflydelse på nervecellernes henfald og mekanismerne bag nervedøden.
De tre nævnte typer receptorer danner alle ionkanaler, som gør det muligt for positivt ladede atomer at trænge ind i cellen. Når receptorerne aktiveres af deres repektive signalstof eller af glutaminsyre, sker der en øget indstrømning af ioner gennem ionkanalen.
Arten af de indstrømmende ioner afhænger af receptortypen. Kalciumioner er specielt interessante, fordi de spiller en rolle for celledøden i hjernen ved neurodegenerative sygdomme. Kalcium har let ved at trænge gennem NMDAreceptorerne, mens AMPA- og kainsyrereceptorerne kun er gennemtrængelige for kalcium under særlige omstændigheder. AMPA-receptorer er hovedsagelig gennemtrængelige for natrium-ioner.
AMPA-receptorer er ionkanaler
I et nyt studie har vi undersøgt AMPA-receptorernes evne til at fremkalde celledød. Når receptoren aktiveres af glutaminsyre eller AMPA, vil kanalen åbnes, og natrium vil strømme igennem kanalen, så længe den er åben. AMPA-receptorer kan dog også i særlige tilfælde lade kalciumioner strømme igennem receptorkanalen. Dette sker, når sammensætningen af receptoren er af en bestemt karakter.
Når AMPA-receptorerne dannes i cellemembranen, sættes de sammen af fire underenheder. Disse fire underenheder, som kaldes GluR1, GluR2, GluR3 og GluR4, samles i forskellige komplekser med fire eller fem i hver, hvorved receptorstrukturen og ionkanalen dannes.
Hvis GluR1, GluR3 og GluR4 samles i en AMPA-receptor, vil ionkanalen være gennemtrængelig for kalcium. Men hvis GluR2 indgår i receptorkomplekset, kan receptoren ikke længere lede kalcium gennem ionkanalen og ind i cellen. Det indebærer, at kun natrium kan strømme gennem disse typer af AMPA-receptorer.
Ved undersøgelser af AMPA-receptorers sammensætning i den intakte hjerne, har man fundet, at de fleste AMPAreceptorer indeholder GluR2. Det vil sige, at flertallet af AMPA-receptorerne i hjernen ikke eller kun i ringe grad er gennemtrængelige for kalcium.
Giftvirkninger på nerveceller
Undersøgelser af stoffers giftvirkninger på nerveceller kan med fordel foretages på dyrkede nerveceller fra eksempelvis mus. Under de korrekte betingelser kan cellekulturen give svar på teststoffernes virkning, deres rolle i celledød, deres evne til at øge koncentrationen af kalcium i cellen og meget andet.
Vi har undersøgt AMPA's toksiske effekt på nerveceller dyrket i kultur. Påvirkningen af AMPA nedsætter procentdelen af levedygtige celler sammenlignet med de ubehandlede celler. Ved påvirkning af cellerne med AMPA i seks timer mister omkring 40 procent af cellerne deres levedygtighed, mens ubehandlede celler alle overlever. AMPA udøver således en giftvirkning på cellerne.
Mange receptorer har en evne til at desensibilisere, hvilket vil sige, at receptoren lynhurtigt inaktiveres efter, at signalstoffet har bundet sig til receptoren. Denne inaktivering af receptoren er vedvarende, selv om signalstoffet stadig er tilgængeligt. AMPA har netop denne evne til at inaktivere AMPA-receptorer, og hvis dette ikke var tilfældet, ville stoffets toksiske effekt være langt kraftigere. Derfor har desensibiliseringen stor betydning for AMPA's evne til at fremkalde celledød.
Receptorens nedsatte følsomhed ved vedvarende kontakt med AMPA er beskyttende for cellekulturen, således at færre celler bliver skadet. Det ses, hvis man reducerer desensibiliseringen af receptorerne, hvilket kan gøres ved at tilsætte stoffet cyclothiazid til cellekulturen sammen med AMPA. Cyclothiazid hæmmer AMPA's evne til at inaktivere receptorerne ved vedvarende påvirkning. Derfor bliver flere receptorer ved med at være aktive, hvorved AMPA's giftvirkning på receptorerne øges. Resultatet er, at andelen af levedygtige celler falder sammenlignet med den påvirkning AMPA alene udøver på cellerne.
Under normale tilstande i hjernen beskytter den hurtige desensibilisering af AMPA-receptorerne mod skadevirkninger af AMPA og glutaminsyre. Men under sygdomstilstande, hvor desensibiliseringen måske er ophævet, vil AMPA-receptorerne kunne udøve en betydelig skade på nervecellerne.
- Figuren illustrerer den toksiske effekt af AMPA ved påvirkning af en 12 dage gammel cellekultur. Giftvirkningen er udtrykt som procent levedygtige celler i forhold til ubehandlede celler (rød søjle), som er 100%. Cellernes evne til at omsætte MTT til formazan blev brugt som mål for levedygtighed. Cellekulturen blev udsat for påvirkning med 500 μM AMPA (blå søjle) og 25 μM AMPA plus 50 μM cyclothiazid (grøn søjle).
Kalcium er gift for nerveceller
Undersøgelser af mekanismerne bag forgiftning af nerveceller sætter normalt fokus på kalciumioner. Denne ion spiller nemlig vigtig rolle for den celledød, som skyldes en overstimulering af glutaminsyre receptorerne.
Når nervecellerne stimuleres med glutaminsyre stiger mængden af frie kalciumioner inde i cellerne. Hvis den intracellulære koncentration af kalcium vedbliver med at være forhøjet gennem kortere eller længere tid, aktiveres forskellige skadelige stoffer inde i cellen. F.eks. øges dannelsen af frie radikaler, som derefter ødelægger cellens struktur, hvorved cellen dør.
Da kalcium spiller så stor en rolle for celledød, er det væsentligt at undersøge, hvorvidt kalcium har betydning for den celledød, der er observeret efter aktivering af AMPAreceptorerne. En øget indstrømning af kalciumioner under aktivering af disse receptorer kan for eksempel øge den resulterende celledød. Det vil sige, at nerveceller, der har AMPA-receptorer indeholdende GluR2 i receptorkomplekset, kunne tænkes at være mere modstandsdygtige over for en påvirkning fra AMPA og glutaminsyre, fordi kalcium ikke eller næsten ikke kommer ind i cellen.
Spørgsmålet kan undersøges ved hjælp af koboltfarvning. Denne metode er designet således, at kun AMPAreceptorer, der er gennemtrængelige for kalcium, kan optage kobolt gennem receptorkanalen. Den kobolt, som ophobes i cellerne kan efterfølgende farves med en svovlforbindelse og forstærkes med en sølvfarvning. Nerveceller, som har optaget kobolt, indeholder AMPA-receptorer, der er gennemtrængelige for kalcium.
Disse nerveceller er sandsynligvis mere udsatte ved en blodpropper eller under epileptiske anfald, fordi kalcium vil strømme ind i cellerne, når receptorerne aktiveres. Dette studie har dog vist, at kun omkring en femtedel af nervecellerne i kulturen har AMPA-receptorer, der er gennemtrængelige for kalcium. Resultaterne af nærværende studie synes således at pege på, at desensibilisering er vigtigere end kalciumgennemtrængelighed for den AMPA-receptor medierede celledød.
- Denne figur viser en koboltfarvning af en 12 dage gammel cellekultur. Nervecellerne er blevet stimuleret i 20 min med en buffer indeholdende kobolt og 25 μM AMPA plus 50 μM cyclothiazid. Herefter er cellerne blevet farvet med en svovlforbindelse og efterfølgende er farvningen forstærket med sølv. De sorte nerveceller har optaget kobolt og har derfor AMPA-receptorer, som er gennemtrængelige for kalcium.
