Antisense-medicin - en vej til bedre lægemidler
Antisense-medicin består af korte DNA sekvenser, som kan hæmme gener i at danne sygdomsfremkaldende proteiner. Selv om det første antisense-lægemiddel netop er markedsført i USA, er der behov for basal forskning i den lovende teknologi.
Af Lise Smith, Jerzy W. Jaroszewski, Klaus Bahl Andersen og Lars Hovgaard
Fra Lægemiddelforskning 1999
Der har i mange år været en intens offentlig debat om genterapeutisk behandling af sygdomme. Hele debatten har været præget af bekymringer af etisk karakter - med eller uden berettigelse. Imidlertid bør man inddele de genetiske behandlingsformer i tre principielt forskellige hovedområder, der kan medføre en mere eller mindre permanent ændring i genmaterialet: Genterapi, DNA-vacciner og antisense- medicin.
Ved traditionel genterapi indsættes en korrekt udgave af et sygt gen i en celle. Her skal det indsatte gen danne den rette version af det protein, som er misdannet eller mang lende på grund af sygdommen. Genterapi benyttes bl.a. eksperimentelt ved behandling af arvelige sygdomme som f.eks. cystisk fibrose.
DNA-vaccination forsøges anvendt imod kræft og alvorlige virussygdomme, men også mod almindelige infektionssygdomme. Traditionelle vacciner består ofte af døde eller svækkede sygdomsfremkaldende bakterier eller vira, som sætter kroppens immunforsvar i alarmberedskab overfor den pågældende mikroorganisme. Ved DNA-vaccination indfører man et gen, som koder for et eller flere proteiner fra mikroorganismernes overflade. Man risikerer derfor ikke at pådrage sig den sygdom, som vaccinen er rettet imod.
Antisense-terapi virker på en tredie måde; nemlig ved at blokere produktionen af sygdomsfremkaldende proteiner. Når et gen skal danne sit protein, udsender genet en enkeltstrenget kopi af sig selv, budbringer-RNA, som bevæger sig hen til cellernes proteinfabrikker, der aflæser opskriften og producerer proteinet. Antisense-medicin består ligeledes af en genstreng. Den binder sig nu til budbringer-RNA, hvilket hindrer proteinfabrikkerne i at aflæse opskriften og danne proteinet.
Antisense-medicin tegner især lovende til behandling af arvelige sygdomme, kræft og infektionssygdomme. Ved arvelige sygdomme og kræft slukker antisense-medicinen for produktionen af sygdomsfremkaldende proteiner, og ved behandling af infektionssygdomme blokeres dannelsen af udvalgte proteiner, som de sygdomsfremkaldende mikroorganismer behøver for at overleve.
DNA-gruppen på Danmarks Farmaceutiske Højskole beskæftiger sig med flere aspekter af farmaceutisk fremstilling af DNA til medicinsk behandling. Projekterne strækker sig fra formuleringer af DNA-vacciner over studier af, hvordan cellerne optager gener ved genterapi, til fremstilling af antisense-præparater. Denne artikel beskriver antisense-terapi og berører de fremskridt, der er set i DNA-forskningsgruppen.
- Budbringer-RNA er målet for antisense-medicinen. Budbringer-RNA er en linær polymer, som folder sig sammen i cellen. Kendskab til foldningen er nødvendig for at skræddersy antisense-molekylet. Her ses en computergrafisk gengivelse af et budbringer-DNA's (for GFP) foldede struktur opnået ved hjælp af M-FOLD programmet. Åbne regioner er potentielt mere attraktive som mål for antisense-molekyler.
Specifik virkning med antisense-medicin
I traditionel medicinsk behandling, f.eks. kemoterapi mod cancer, forsøger man med større eller mindre held at slå celler med defekte gener ihjel. Specificiteten i denne behandling er yderst begrænset, fordi raske celler også rammes, og bivirkningerne er derfor betydelige og ubehagelige for patienten. Behandlingen af en lang række virussygdomme som AIDS, Herpes simplex og simpel influenza er ligeledes vanskelig og uspecifik.
Medicin, som virker på genniveau, åbner mulighed for udvikling af langt mere specifikke behandlingsformer. Sideløbende med at det humane genoms kode opklares, og metoderne til DNA-sekventering hele tiden forbedres, opbygges en stor viden om præcis hvilke sekvenser i et gen, der er ansvarlige for dannelsen af syge celler eller forkert fungerende proteiner. Det betyder i praksis, at behandlingen i flere og flere tilfælde kan ramme sygdomskilden direkte. Til dette formål er antisense-genstrenge oplagte kandidater.
DNA er opbygget af fire forskellige byggesten, kaldet baser, som ved simpel kemisk sammenkobling danner lange kæder af DNA. Hvis man kender sekvensen for det sygdomsfremkaldende gen, kan man fremstille den komplementære sekvens på typisk 15-20 baser. Denne korte kæde er det nye lægemiddelstof, som kan blokere det defekte gen.
Valg og test af antisense-sekvensen
Teorien bag antisense er smuk og tilsyneladende ukompliceret. Men i praksis er der mange vanskeligheder. For det første er budbringer-RNA meget store makromolekyler, hvilket gør det svært at målrette antisense-genstrengen, så den binder sig optimalt til budbringer-RNA. Budbringer-RNA er lineære polymerer, men de optræder ikke som sådan. I stedet folder de sig selv op i en sekundær konformation, som er speciel for hver enkelt udgave af budbringer-RNA. Foldningen er styret af, at molekylet ønsker at optræde i den lavest mulige energitilstand. I udvælgelsen af antisense-molekylerne må man således tage hensyn til, hvordan det pågældende budbringer-RNA folder sig sammen.
Antisense-molekylerne kan udvælges på en række forskellige måder. I forskningsgruppen anvendes en computergrafisk metode til at finde egnede, tilgængelige områder i budbringer-RNA. Udvalgte antisense-molekyler testes derefter i en cellemodel, som udtrykker det grønne fluorescerende protein GFP. I det omfang antisense-molekylerne hæmmer budbringer-RNA, produceres GFP ikke og den grønne farve forsvinder fra cellerne. Derudover benytter vi cellefrie analysesystemer, som indeholder alle de komponenter, der er nødvendige for proteinsyntesen, og hæmmer målgenet her. På disse måder er det muligt at teste for en lang række potentielle antisense-effekter.
- Antisense-molekyler har mange mulige virkningsmekanismer. Antigent: 1 – forhindrer transkription. Antisense: 2 - blokerer for transport af RNA fra cellekerne til cellernes proteinfabrikker; 3 - hæmmer proteinsyntesen; 4 - forhindrer proteinsyntesens start. RNase-H induktion: 5 - inducerer intracellulær nedbrydning af budbringer-RNA. Protein foldning: 6 - påvirker færdige proteiners tredimensionelle struktur.
Vejen ind i målcellerne
Når egnede kandidater er udvalgt, går det farmaceutiske formuleringsarbejde i gang. Antisense-molekyler er polære makromolekyler med en negativ ladning, og de er samtidig vandopløselige. Derfor har de kun en lille chance for på egen hånd at trænge igennem den fedtholdige cellemembran og ind i cellerne, hvor de udøver deres effekt.
Derfor arbejder vi med transportmolekyler, som kan fragte antisense-medicinen ind i cellerne. Positivt ladede poly-L-lysiner er blandt kandidaterne. Disse polymerer udvikles i samarbejde med professor Glen Kwon fra universitetet i Wisconsin, USA. Polymererne kompleksbinder antisensemolekylerne takket være tiltrækningen mellem de positivt ladede polymerer og de negativt ladede antisense-strenge.
I en række indledende studier med komplekserne har det vist sig, at det sandsynligvis er muligt at øge cellernes optag af antisense-molekyler. Dermed er der forhåbning om, at det bliver lettere at opnå terapeutiske koncentrationer i målcellerne.
Behov for basal grundforskning
Den amerikanske biotech virksomhed ISIS har slået sig op på antisense-området og har over en periode på et årti været hele forskningsfeltets opture og nedture igennem. Imidlertid har ISIS nu markedsført det første antisense-præparat, Vitravene®, som er et lægemiddel til behandling af en HIVrelateret øjeninfektion. I dette produkt er der tale om en simpel opløsning af antisense-medicinen i en vandig buffer til lokal applikation i øjet.
For at mere avancerede antisense-præparater i fremtiden skal have en chance, er det nødvendigt at udvikle farmaceutiske formuleringer, som kan tre ting. For det første skal formuleringerne kunne beskytte antisense-molekylerne mod nedbrydning i kroppen. For det andet skal de være i stand til at styre lægemiddelstoffet hen til det rette organ. For det tredie er det nødvendigt at øge cellernes optag af medicinen.
Det er derfor vigtigt at indsamle faktuelle data om kinetikken og mekanismerne i den subcellulære transport, om stabiliteten og om mulighederne for at anvende eksisterende farmaceutiske formuleringsmetoder for at kunne udvikle disse bioteknologiske lægemidler til bred fremtidig anvendelse.
Projektet er bl.a. støttet af Centre for Drug Design and Transport.Hent artiklen i pdf-format
