DNA-vacciner: Stort potentiale - store udfordringer
Udvikling af nye og mere effektive vacciner har stor betydning for at forbedre folkesundheden i verden. Her kan DNA-vacciner beskytte mod sygdomme uden de traditionelle vacciners ulemper. Imidlertid er det svært at fremstille effektive DNA-vacciner; især når de skal indtages gennem munden. DFH tager udfordringen op.
Af Annette Vinther Heydenreich, Karin Bryder, Anders Fomsgaard og Lars Hovgaard Fra lægemiddelforskning 2000
DNA-vacciner har stort potentiale, specielt når det gælder beskyttelse mod virussygdomme som AIDS, herpes, influenza og hepatitis, hvor DNA-vaccinerne får kroppen til at efterligne det immunrespons, som opstår ved virusinfektioner.
Samtidig er DNA-vacciner yderst attraktive, fordi de ikke medfører nogen infektionsrisiko modsat traditionelle vacciner, der består af svækkede eller døde bakterier eller virus. Her er der altid en principiel risiko for, at svækkede mikroorganismer kan mutere til sygdomsfremkaldende former, eller at enkelte mikrober i død vaccine ikke er slået ihjel.
Et af de store mål på internationalt plan er at udvikle en DNA-vaccine mod HIV, som er det virus der forårsager AIDS. Her vil man foretrække en vaccine, som indgives gennem munden eller via andre slimhinder i kroppen, således tilstedeværelsen af sundhedsfagligt personale ikke er nødvendigt. Desuden vil en immunisering af de relevante slimhinder forventes at producere et forsvar, som allerede ved optagelsen af virus kan bremse infektionen ved slimhinden. På den måde undgår man, at HIV angriber immunsystemet.
DNA-vacciner har også den fordel, at DNA er let og billigt at producere, hurtigt kan testes og er mere temperaturstabilt end almindelige vacciner. I fremtiden kan man forestille sig samtidig vaccination for flere sygdomme på grund af muligheden for at indsætte gener fra en vifte af mikroorganismer i DNA-vaccinen. På den måde vil immunforsvaret blive sat i alarmberedskab over for flere typer infektioner på én gang.
Princippet i DNA-vacciner
DNA-vacciner er baseret på gener, der danner et overfladeprotein fra den mikroorganisme, som man ønsker beskyttelse imod, f.eks. en virus. Vaccinen fremstilles ved at indsætte genet for det ønskede virusprotein i et plasmid, som er et lille ringformet stykke DNA. Efter vaccinationen udtrykkes genet i celler i lymfesystemet, hvorved cellerne danner virusproteinet på deres overflader. Proteinet sætter nu immunforsvaret i alarmberedskab overfor den pågældende virus på samme måde, som en almindelig vaccine gør det. Immunsystemet genkender det producerede virusprotein som fremmed, hvorved et beskyttende immunrespons iværksættes.
Immunforsvaret reagerer på to måder efter en DNAvaccination. For det første dannes der antistoffer, som neutraliserer virusproteinet og som senere vil gøre det samme, hvis personen skulle blive smittet med det pågældende virus. For det andet medfører DNA-vaccinationen, at der produceres T-celler, som dræber de inficerede celler. T-celler dannes sjældent ved brug af konventionelle vacciner, men de antages at være essentielle for at skabe en immunisering mod virus som HIV samt ved fremstilling af kræftvacciner.
Selvom det er over ti år siden, at princippet bag DNAvacciner blev beskrevet og fundet værdifuldt, er der endnu ikke markedsført vacciner af denne type. Det skyldes især, at det er vanskeligt at udvælge de overfladeproteiner fra virus og bakterier, som DNA-vaccinen skal danne, samt at DNA kun i meget ringe grad optages i kroppens celler.
For at opnå en tilstrækkelig optagelse i cellerne må man enten skyde DNA direkte ind i cellerne eller maskere DNAvaccinen. Hertil benyttes tomme virus, polymerer eller liposomer, som er kugleformede sække af fedtstoffer. Endelig giver DNA-vacciner som andre genteknologiske lægemidler anledning til etiske overvejelser, da de principielt set kan blive integreret i arveanlæggene. Ingen af de hidtidige studier har imidlertid vist, at dette sker i praksis.
- Mange barrierer i kroppen skal passeres, og mange processer skal styres for at opnå en virksom DNA-vaccine, som kan indtages gennem munden: 1) Nedbrydning i mave-tarmkanalen skal undgås. 2) Vaccinen skal passere over tarmvæggen. 3) Derefter skal vaccinen optages af lymfesystemets antigen-præsenterende celler, som findes på den anden side af tarmvæggen, og her skal cellemembranen passeres. 4) Ved optagelsen i cellen pakkes plasmidet med DNAvaccinen ind i endosomer; som under transporten gennem cellen smelter sammen med små sække kaldet lysosomer, der indeholder nedbrydende enzymer. Plasmidet skal frigives til cellevæsken, før det nedbrydes enzymatisk i lysosomerne. 5) Plasmidet bevæger sig hen til cellekernen, hvor det skal være i stand til at trænge ind gennem kernemembranen. 6) DNA-vaccinen aflæses i cellekernen. 7) Derpå produceres det protein fra en virus eller en bakterie, som vaccinen koder for. 8) Endelig skal det artsfremmede protein præsenteres på cellens overflade til genkendelse for immunsystemet. (Ill. Mette Langebæk)
Svær formulering
Selvom adskillige kliniske studier har vist beskyttende immunitet ved DNA-vaccination, er optagelsen af plasmider i cellerne ineffektiv, og det samme gælder cellernes produktion af de proteiner fra virus eller bakterier, som DNA-vaccinen indeholder opskriften på. Det er ofte nødvendigt at anvende store mængder plasmid, selvom det er tilstrækkeligt, at bare 100-1000 celler præsenterer de artsfremmede proteiner på deres overflade.
Den lave optagelse i cellerne skyldes især DNA-molekylets fysiske og kemiske egenskaber. Molekylet er stort og har derfor svært ved at passere cellemembranen, og samtidig er molekylet vandopløseligt, hvilket ligeledes vanskeliggør passagen over de fedtholdige cellemembraner. Desuden nedbrydes DNA-vaccinen af enzymer både i blodet og i cellerne, og endelig er det nødvendigt at få transporteret vaccinen hen til de celler i lymfesystemet, som præsenterer artsfremmede proteiner for immunforsvaret.
På trods af intens forskning er udvalget af anvendelige transportsystemer endnu begrænset. Til DNA-vaccination har man hovedsagelig anvendt to metoder. Den første er injektioner i muskler eller under huden med nøgent DNA. Den anden er gen-pistoler, hvor DNA-vaccinen kobles til guldpartikler, som så skydes direkte ind i hudceller.
Ved normal cirkulation i kroppen kommer DNA-vaccinen ind i cellerne ved, at vaccinen under optagelsen omsluttes af små sække, som kaldes endosomer. Endosomerne smeltes sammen med andre sække, lysosomer, som har lav pH og indeholder store mængder enzymer, som nedbryder DNA. Derfor bør plasmiderne være beskyttede, så de forlader endosomerne i intakt stand, hvilket kan gøres ved at indpakke plasmiderne i fedtstoffer eller polymerer. Endelig skal plasmiderne være i stand til at trænge gennem kernemembranen. Først når DNA-vaccinen er kommet ind i cellekernen, aflæses opskriften på det artsfremmede protein, som derefter produceres af cellernes proteinfabrikker i cellevæsken.
Mulig oral DNA vaccine
Vanskelighederne bliver endnu større, når DNA-vaccinen skal indgives via munden. Her må man både beskytte vaccinen mod enzymatisk nedbrydning i mave-tarmkanalen og i blodet.
Vi arbejder på at udvikle et transportsystem baseret på faste fedtpartikler med en størrelse på 100-300 nanometer. Her kan DNA enten indkapsles i en lipidmatrix eller bindes på partiklernes overflade. Lipidernes faste form bevirker, at DNA-vaccinen frigives langsomt ved enten diffusion eller erosion, hvorved der både opnås en forlænget afgift og en beskyttelse af DNA-vaccinen.
Lipidpartiklerne kan fremstilles af ugiftige stoffer. Ved at benytte positivt ladede komponenter kan partiklerne fremstilles med en positiv overfladeladning, således at de kan kompleksbinde det negativt ladede DNA, så vaccinen pakkes på overfladen. Vi ønsker imidlertid ikke ladningsneutralitet af komplekserne, men en positiv nettoladning, som øger partiklernes vekselvirkning med den negativt ladede cellemembran.
Forsøg med mus
Partikler af størrelser mellem 50 nanometer og 5 mikrometer kan passere tarmvæggen i begrænset omfang - jo mindre partikler, i jo højere grad passerer de væggen og optages i blodet. Dette sker primært i afgrænsede områder i tarmen, som direkte er forbundet med lymfesystemet. Ved potente lægemiddelstoffer som DNA-vacciner, der indgives i små mængder, vil denne optagelsesvej kunne anvendes.
Orale immuniseringsforsøg er igangsat på mus for at undersøge, i hvilket omfang antistoffer dannes i livmoderslimhinden, endetarmen og blodbanen. Såfremt et positivt resultat opnås, vil T-celle produktionen mod HIV blive undersøgt. Det langsigtede mål er DNA-vacciner, der kan indgives i tabletform.
Projektet er støttet af bl.a. Centre for Drug Design and Transport.
