Design af lægemidler mod neurodegenerative sygdomme
Signalstoffet glutaminsyre er involveret i bl.a. Alzheimers sygdom og akutte hjerneskader. Det er nu muligt at bestemme den tredimensionelle struktur af bindingsstedet i receptorer for glutaminsyre. Det åbner vejen for en forståelse for receptorernes funktion og for målrettet design af nye lægemidler.
Af Anders Hogner, Marie-Louise Lunn, Jette Sandholm Kastrup, Ingrid Kjøller Larsen, Tommy Liljefors og Jan Egebjerg
Fra Lægemiddelforskning 2000
Glutaminsyre er hjernens vigtigste stimulerende signalstof, som er involveret i mange vigtige funktioner, f.eks. indlæring og hukommelse. Men glutaminsyre er et tveægget sværd. Når koncentrationen af signalstoffet bliver for høj i hjernen, overstimuleres nervecellerne, og de går til grunde. Det sker i en række neurodegenerative sygdomme, som spænder fra den langsomt fremadskridende senilitet i Alzheimers sygdom til akutte hjerneskader, som opstår ved hjerneblødning og hjertestop.
Glutaminsyre aktiverer mange typer af receptorer, og for at beskytte hjernens nerveceller mod overstimulering er det vigtigt at udvikle lægemiddelstoffer med specifik virkning på de enkelte receptortyper.
Der er to hovedgrupper af glutaminsyre-receptorer, som kaldes ionotrope og metabotrope. De ionotrope receptorer inddeles videre i tre grupper, NMDA, AMPA og kainsyrereceptorer. For hver af disse grupper er der forskellige receptortyper alt efter, hvilke underenheder receptorerne består af. AMPA-receptorerne er et proteinkompleks i cellemembranen, bestående af fire eller fem af underenhederne GluR1-4, mens kainsyre-receptorerne er sat sammen af underenhederne GluR5-7 og KA1-2.
Underenhederne ligner hinanden meget med hensyn til rækkefølgen af de aminosyrer, de er opbygget af. Men alligevel har de vidt forskellige rumlige faconer. Dét medfører, at der er forskel på, hvor godt de forskellige receptortyper binder stoffer, som har en stimulerende eller hæmmende virkning på receptoren.
Receptormodeller
Det er vigtigt at kunne designe lægemiddelstoffer med specifik virkning på de enkelte typer af receptorer. Det har ikke tidligere været muligt på grund af manglende viden om strukturen af de enkelte underenheder.
I den seneste tid er situationen imidlertid blevet ændret radikalt. Med genteknologi kan man nu fremstille den del af receptoren, som binder glutaminsyre og lægemiddelstoffer. Det har vist sig, at bindingslommen findes på ydersiden af cellemembranen mellem to proteinkæder, som kaldes for S1 og S2.
Ved hjælp af genteknologi er det lykkedes at klippe begge kæder af ved cellemembranen og erstatte de dele af receptoren, som går gennem membranen, med en kort peptidkæde. Derved har man opnået et mindre protein, som har bevaret sin evne til at binde signalstoffer og lægemiddelstoffer. Miniproteinet kan derfor anvendes som en model for receptoren.
- Modeltegning af en ionotrop glutaminsyre-receptor bestående af fire underenheder indlejret i cellemembranen. I den ene underenhed er vist den bindingslomme for signalstoffer, som peptiderne S1 og S2 danner. Den punkterede streg illustrerer den peptidkæde, der er sat ind ved hjælp af genteknologi i stedet for de dele af underenheden, der normalt går gennem cellemembranen. På den måde er det lykkedes at fremstille en miniudgave af proteinet, som kan krystalliseres og strukturbestemmes ved røntgenkrystallografi.
Røntgenkrystallografi viser strukturen
Fordelen ved miniproteinet er, at chancen for, at proteinet er krystalliserbart, øges væsentligt. At krystallisere proteinet er en nødvendighed for at opklare proteinets tredimensionelle struktur ved hjælp af røntgenkrystallografi.
Forskere på Columbia University i New York har for nylig krystalliseret miniproteinet af AMPA-receptoren GluR2 sammen med et signalstof, som er bundet til receptoren. Derpå bestemte de strukturen af bindingslommen og det bundne signalstof ved hjælp af røntgenkrystallografi.
Her belyses krystallen med intens røntgenstråling, og strålerne spredes af atomerne i det krystalliserede protein. Resultatet er et spredningsmønster, som kan bruges til at beregne, hvilke atomer proteinet er opbygget af, og hvordan atomerne er placeret i forhold til hinanden. På den måde får man detaljerede oplysninger om proteinets tredimensionelle struktur.
Strukturen af protein-signalstof komplekset viser, hvor i receptoren signalstoffets bindes, og giver desuden præcis viden om, hvilke aminosyrer i bindingslommen signalstoffet har kontakt til, f.eks. via brintbindinger eller saltbroer.
- I formelskemaet er vist strukturen af tre AMPA-receptor stimulerende stoffer og et AMPA-receptor blokerende stof. Alle fire forbindelser er blevet krystalliseret med AMPA-receptor miniproteinet af GluR2 med henblik på strukturbestemmelse ved hjælp af røntenkrystallografi.
Binding af modelstoffer
På Institut for Medicinalkemi er det fornylig lykkedes, i samarbejde med de amerikanske forskere, at krystallisere miniproteinet af AMPA-receptoren GluR2 sammen med en række modelstoffer. Nogle af disse stoffer aktiverer receptoren og stimulerer nervecellen, mens andre af stofferne binder sig til receptoren uden at aktivere den. Sådanne stoffer kan blokere receptoren for glutaminsyre og dermed hæmme nervecellens aktivitet.
Modelstofferne er designet og syntetiseret af den medicinalkemiske gruppe på instituttet, og forbindelsernes strukturkemi og farmakologi er undersøgt nøje. Der er nu samlet røntgendata af miniproteinet sammen med tre stimulerende stoffer 2-Me-Tet-AMPA, Br-HIBO og ACPA samt for det blokerende stof ATPO. Den tredimensionelle struktur er løst for de to førstnævnte stoffer.
De strukturelle studier af de ionotrope glutaminsyre-receptorer omfatter også andre typer end AMPA-receptorerne. Et modelprotein af en af underenhederne i kainsyre-receptoren er allerede fremstillet genteknologisk, og andre er klonet og udtrykt i kolibakterier for derefter at blive isoleret, oprenset og farmakologisk karakteriseret. Også disse proteiner vil blive krystalliseret sammen med forskellige modelstoffer med henblik på at bestemme den tredimensionelle struktur af komplekserne ved hjælp af røntgenkrystallografi.
- Strukturen af bindingslommen i AMPA-receptor underenheden GluR2 i kompleks med det stimulerende modelstof 2-Me-Tet-AMPA. Peptiderne S1 og S2 er vist i henholdvis lilla farve og grøn farve, medens peptidkæden, som sammenknytter S1 og S2, nederst i molekylet er orange. Modelstoffet 2-Me-Tet-AMPA ses midt i molekylet mellem S1 og S2.
Computerkemi og lægemidler
Strukturopklaring af en lang række forskellige receptor-signalstof komplekser vil give værdifuld information om stoffernes samspil med receptoren og om formen af bindingslommerne på de forskellige receptortyper.
Detaljeret viden herom er af afgørende betydning for at opklare sammenhængen mellem modelstoffernes struktur og deres biologiske funktion, dvs. evnen til at stimulere eller blokere forskellige typer af glutaminsyre-receptorer. Samtidig vil det blive muligt at opklare strukturelle forskelle mellem de forskellige receptortyper. Hermed er døren åben for strukturbaseret design af lægemiddelstoffer, hvorved nye og bedre lægemidler mod neurodegenerative sygdomme som f. eks. Alzheimers syge kan udvikles på et rationelt grundlag.
Den strukturelle information om glutaminsyre-receptorerne, som vi opnår ved hjælp af røntgenkrystallografi, anvendes til yderligere karakterisering af bindingslommernes egenskaber ved hjælp af computerbaserede beregningsmetoder. Et tæt samarbejde mellem grupperne, som arbejder med proteinkrystallografi og computerkemi, kan føre til identifikation af de aminosyrer, der er vigtige for bindingen af lægemiddelstoffer.
På den måde kan man klarlægge mekanismen for de enkelte receptortypers funktion, ligesom der vil blive kastet lys på detaljer omkring de enkelte lægemiddelstoffers virkemåde. En anden mulighed, som røntgenstrukturerne åbner op for, er udvikling af modeller for andre undertyper af glutaminsyre-receptorer. Formålet er at uddybe forståelsen for hvilke faktorer, der er bestemmende for, at nogle lægemiddelstoffer påvirker bestemte underenheder af receptorer, men ikke andre.
Projektet er et eksempel på udpræget interdiciplinært samarbejde. Det involverer således molekylærbiologi, proteinkemi, molekylærfarmakologi, proteinkrystallografi, organisk syntese og computerkemi.
