Effektiv analyse af binding mellem proteiner og lægemiddelstoffer
En simpel analytisk metode er velegnet at undersøge lægemiddelstoffers binding til proteiner i blodet - en binding, som spiller en central rolle for mange lægemidlers omsætning i kroppen. Kapillarelektroforese muliggør studier af bindingsfænomener, som det tidligere har været vanskeligt at undersøge.
Af Jesper Østergaard, Claus Selch Larsen, Christian Schou og Niels H.H. Heegaard.
Fra Lægemiddelforskning 2003
Medicinalindustrien syntetiserer i dag et meget stort antal potentielle lægemiddelstoffer, og det stiller krav om udvikling af hurtige og automatiserede analysemetoder til at karakterisere stoffernes farmakologiske egenskaber.
Et af de centrale spørgsmål, når man skal vurdere nye lægemiddelkandidater, er stoffernes skæbne i kroppen - en skæbne, som i høj grad afhænger af proteinbindingen i blodet: Bindes lægemiddelstoffet til proteinerne? Frigives det igen? Og hvor hurtigt sker frigørelsen?
Generelt er det kun den frie andel af et lægemiddelstof i blodet, som kan passere cellemembraner, udøve farmakologisk effekt og blive udskilt gennem nyrerne. Derfor er kendskab til proteinbinding i blodet på et tidligt trin i lægemiddeludviklingen en stor fordel, når man søger at identificere de stoffer, som har de største chancer for at blive til færdige lægemidler.
Analyser med kapillarelektroforese har et stort potentiale i forbindelse med bindingsstudier. Her beskriver vi principperne bag analysemetoden, som har vist sig særdeles anvendelig til at studere lægemiddelstoffers binding til proteiner i blodet.
Kapillarelektroforese
Elektroforese adskiller elektrisk ladede molekyler i en blanding. Metoden bygger på bevægelse af ioner i et elektrisk felt. Når en spændingsforskel påføres over to elektroder, vil ionerne bevæge sig i retning mod den modsat ladede elektrode. Deres hastighed afhænger af molekylernes ladning og størrelse, og derved kan forskellige ioner separeres. Små molekyler med høj elektrisk ladning bevæger sig hurtigere i det elektriske felt end store molekyler med lav elektrisk ladning.
Kapillarelektroforese er en effektiv udgave af metoden, som anvendes til adskillelse af komplekse stofblandinger. I modsætning til traditionel elektroforese, hvor ionerne bevæger sig gennem en gel, foregår separationen i en væske. Det gør, at systemet er meget velegnet til at simulere bindinger mellem molekyler i blodet.
Separationen finder sted i tynde bufferfyldte kvartsrør, kapillærer, som typisk er 25-75 cm lange og har en indre diameter på 25-75 μm. Rørets dimensioner gør, at en meget højt elektrisk feltstyrke kan anvendes, og samtidig skaber kvartsoverfladen en væskestrøm gennem røret, som fører alle stofferne i prøven hen mod den negative elektrode, hvor de detekteres.
Positivt ladede ioner bevæger sig hurtigt hen til den negative elektrode, mens negativt ladede ioner stritter imod og når senere hen til elektroden. Ionernes størrelse og ladning afgør, hvor hurtigt de kommer hen til detektoren.
Detektionen sker normalt ved hjælp af ultraviolet lys, som sendes ind i røret gennem et vindue. Når et stof, som absorberer lys ved den anvendte bølgelængde, passerer vinduet, opstår der et absorptionssignal, som er proportionalt med koncentrationen af stoffet.
Bindingsstudier
- Forsøgsopstillingen til kapillarelektroforese: Kvartskapillaret har en indre diameter på 50 μm og en ydre diameter på 365 μm. Detektion med ultraviolet lys foregår gennem et vindue i kapillaret.
- Binding af lægemiddelstoffet warfarin til plasmaproteinet albumin studeret ved kapillarelektroforese. UV-signalet for warfarin er afbildet med en tyk linje, signalet fra albumin er afbildet med en tynd linje (d). Albumin er et meget større molekyle end warfarin; det bevirker, at binding af warfarin til albumin ikke påvirker den hastighed, hvormed albumin bevæger sig i kapillaret. Bundet warfarin vandrer med samme hastighed som albumin, frit warfarin er længere tid om at nå detektoren. Der observeres to plateauer for warfarin (a og b). Højden af plateauet inden i albuminsignalet (b) er et udtryk for den totale warfarin koncentration i den analyserede prøve, i dette plateau er bindingsligevægten mellem warfarin og albumin opretholdt. Plateauet udenfor albuminsignalet (a) skyldes frit warfarin, højden er proportional med den fri warfarin koncentration i prøven. Forholdet mellem UV-signalets størrelse ved de to plateauer giver den fri andel af warfarin (ca 60%) i prøven og beskriver dermed bindingen mellem de to molekyler. Plateauhøjden (b) kan som oftest ikke bestemmes direkte og bestemmelse af den frie fraktion sker ved hjælp af en warfarinopløsning uden albumin med samme koncentration som prøven (e). Den faldende warfarin koncentration i området (c) skyldes, at bindingsligevægten ikke kan opretholdes på grund af tilførsel manglende warfarin.
Under visse omstændigheder kan kapillarelektroforese anvendes til at studere, hvordan to stoffer interagerer med hinanden. Her er det et krav, at mindst et af de vekselvirkende molekyler bærer en elektrisk ladning, samt at interaktionen medfører et skift i den hastighed, som et af molekylerne bevæger sig med i det elektriske felt.
Når betingelserne er opfyldt, er det muligt at anvende kapillarelektroforese til at analysere lægemiddelstoffers binding til de proteiner, som findes i blodet. Vi har brugt metoden til at studere reversibel binding mellem lægemiddelstoffer og proteinet albumin, som er et naturligt forekommende bæremolekyle i humant blod.
Forsøgene bygger på følgende procedure: Først fremstilles en prøve, som indeholder albumin og det lægemiddelstof, hvis binding vi ønsker at studere. Så indføres 50-200 nanoliter af prøven i kvartsrøret. Herefter påføres der spænding over kapillaret, og adskillelsen af frit lægemiddelstof fra frit albumin og komplekser af albumin og lægemiddelstoffet begynder.
Et typisk eksperiment tager mellem 5 og 25 minutter afhængig af lægemiddelstoffets vandringshastighed i røret. Metoden er en hurtig og enkel måde at studere lægemidlers binding til plasmaproteiner på. Man kan sammenligne med en traditionel ligevægtsdialyse, hvor forsøgene varer mellem 6 og 20 timer. Samtidig kræver dialyseforsøg et langt større prøvevolumen.
Desuden er bindingsstudier ved kapillarelektroforese mindre arbejdstunge. Separation af frit lægemiddelstof fra protein og kompleks samt bestemmelse af koncentrationen af frit lægemiddelstof sker i ét integreret trin. Den største ulempe ved metoden er en lav følsomhed, som skyldes begrænsninger i detektion med ultraviolet lys. Anvendelse af mere følsomme detektionsmetoder kan afhjælpe denne begrænsning for flere typer af stoffer.
Fokus på gigt
Kapillarelektroforese er indtil nu især blevet anvendt til at bestemme binding mellem lægemiddelstoffer og plasmaproteiner, og der har overvejende været tale om studier af velkendte stoffers binding til plasmaproteiner, som har bekræftet eksisterende viden og dermed vist metodens egnethed. Men med de fordelagtige egenskaber såsom hurtighed, automatiserbarhed og meget små prøvemængder må det forventes, at kapillarelektroforese fremover vil blive et vigtigt værktøj til at studere binding mellem lægemiddelstoffer og receptorer. Metoden er især velegnet til undersøgelser af stoffer, som er ustabile i opløsning, eller som kun kan fremskaffes i små mængder. På Danmarks Farmaceutiske Universitet er et forskningsprojekt i gang, hvor kapillarelektroforese anvendes til at frembringe viden om lægemiddelstoffers vekselvirkninger med de proteiner, som findes i knæled. Målet er at forbedre behandlingen af forskellige gigtformer.
- Separationsprincippet i kapillarelektroforese. Hastigheden af molekylernes bevægelse i kapillarrøret bestemmes af to bidrag: Strømmen af væske gennem kapillaret, plus bidraget for ladede molekyler på grund af deres vandring i et elektrisk felt. Længden af pilen indikerer den hastighed, molekylerne bevæger sig med. Retningen af pilen viser bevægelsens retning. Væskestrømmen, det elektroosmotiske flow er større end hastigheden af den elektroforetiske vandring, hvilket sikrer, at alle molekylerne bevæger sig hen mod detektoren.
Hent artiklen i pdf-format
