Elektrokemi til karakterisering og kvantitativ analyse af lægemiddelstoffer

Det er af afgørende betydning for at lægemiddelstoffer kan optages i kroppen, at de er egnede til at indgå i en formulering – fx en tablet. Lægemiddelstofoptagelse, fordelingen af lægemiddelstoffet i kroppen, nedbrydning og endelig udskillelse af kroppen kan forudsiges ud fra en række fysisk-kemiske parametre.

Igennem de seneste år har vi på Institut for Farmaci og Analytisk Kemi udviklet nye metoder baseret på elektrokemi til fysisk-kemisk karakterisering af lægemiddelstoffer. Metoderne er specielt velegnede til at beskrive ladede lægemiddelstoffers fordeling ind i lipofile (fedtelskende) miljøer samt til studier af lægemiddelstoffernes vekselvirkninger med hhv. lipofile og hydrofile kompleksbindere. Undersøgelser viser også, hvordan en potentialforskel på dramatisk vis kan påvirke fordelingsforholdene. Endelig har vi været i stand til at miniaturisere metoden, så vi kan analysere ganske få mikroliter (1 mikroliter = 10^-6 L) prøve. Det miniaturiserede format har også vist sig velegnet som en ekstremt følsom detektionsteknik, idet vi har demonstreret detektion af stoffer i en koncentration på få nanomolær (1 nanomolær = 1 nM = 10^-9 mol L^-1).

Potentielle nye lægemiddelstoffer bliver i første omgang testet for deres evne til at binde til specifikke sygdomsrelaterede receptorer. Lægemiddelstofoptagelse, fordelingen af lægemiddelstoffet i kroppen, nedbrydning og endelig udskillelse er bl.a. bestemt af en række fysisk-kemiske parametre som fx opløselighed, pK_a-værdi, fordelingskoefficient (log P) og kompleksbinding.

Fordelingskoefficienten kan bestemmes ved at se på fordelingen ved ligevægt af lægemiddelstoffet i et to-fasesystem bestående af en vandfase og en oliefase. Denne metode er velkendt og meget anvendt for neutrale stoffer, men for ladede lægemiddelstoffer er den problematisk. Det skydes, at det ikke er muligt at ekstrahere enkelte ioner, da der altid vil være modioner tilstede for at sikre elektroneutralitet. Med den elektrokemiske teknik kan det imidlertid lade sig gøre, da vi med nøje udvalgte elektroder kan danne en kompenserende ladning og derved sikre elektroneutraliteten. I alt anvendes 4 elektroder: to elektroder bruges til at etablere en spændingsforskel mellem de to faser, og to elektroder sikrer elektroneutralitet i hhv. vand- og oliefasen.

I vores eksperimenter består "oliefasen" af 1,2-dichlorethan (1,2-DCE). I et typisk eksperiment varieres spændingsforskellen lineært over tid, samtidig med at ionstrømmen måles. Først varieres signalet lineært i positiv retning, hvorefter potentialet varieres i negativ retning tilbage til udgangspotentialet. Denne type eksperimenter betegnes cyklisk voltammetri, og resultatet rapporteres i et cyklisk voltammogram som vist i figuren herunder. Det cykliske voltammogram viser overførslen af lidokainkationen. Lidokain (svag base) er et lokalanalgeticum, hvor syreformen (i det følgende betegnet LidH⁺) har en pKa-værdi på 7,9, dvs det fortrinsvist er positivt ladet ved pH 4,0. Ved lave potentialforskelle ses overførslen af negative ioner fra bufferopløsningen. I midten af potentialvinduet er der et signal stammende fra overførslen af LidH⁺ fra vand til 1,2-DCE. Ved høje potentialer ses signalet svarende til overførslen af bufferopløsningens positivt ladede ioner fra vand til 1,2-DCE. Når potentialet varieres linært tilbage til udganspotentialet ses de samme transportprocesser, blot fra 1,2-DCE til vand. Overførselspotentialet for LidH⁺ beregnes som gennemsnittet af de to toppotentialer i midten af vinduet. Overførselspotentialet svarende til LidH⁺ er proportionalt med fordelingskoefficienten for LidH⁺ og indeholder ikke bidrag fra modioner, som det er tilfældet med andre teknikker.

Eksperimentet giver altså information om LidH⁺ fordelingskoefficienten. I eksperimentet er pH-værdien af vandfasen fastholdt på 4,0 med en eddikesyrebuffer. Øges pH til en værdi tæt på lidokains pKa-værdi bliver fortolkningen af overførselspotentialerne lidt mere kompliceret. Nærmer pH sig 7,9 må der også tages hensyn til den uladede form af lidokain (den frie base) som bliver fordelt ind i 1,2-DCE fasen. I praksis betyder det, at det målte overførselspotential bliver afhængigt af pH i vandfasen.  

I figuren herunder er vist et såkaldt fordelingsdiagram, hvor overførselspotentialet er målt som funktion af pH i vandfasen. Ved lav pH er overførselspotentialet uafhængig af pH, men ved pH større end 6,1 stiger overførselspotentialet med pH. Ved meget høj pH ses der ikke noget signal, da lidokain er på den uladede Lid-form. Linierne i diagrammet viser, hvordan lidokain fordeles i vand/1,2-DCE-systemet som funktion af pH og overførselspotentialer. For eksempel svarer det øverste venstre hjørne til betingelser, hvor Lidokain er protoneret og fordelt ind i oliefasen. Som det ses af fordelingsdiagrammet, kan en potentialforskel mellem de to faser altså på dramatisk vis påvirke fordelingsforholdene.

Når lægemiddelstoffer optages i kroppen skal de ofte passere membraner (fx cellemembraner), hvor der er betydelige potentialforskelle. Den elektrokemiske metode kan give et billede af, hvordan disse potentialforskelle kan påvirke fordelingen og dermed optagelsen af ladede lægemiddelstoffer i kroppen.

Lad os se på eksemplet LidH⁺ ved pH 4,0. Ved en potentialforskel på 120 mV er fordelingskoefficienten for LidH⁺ 1. Ved 0 mV er fordelingskoefficienten 0,01, mens den er 100 ved 240 mV! En relativt beskeden ændring i potentialforskellen mellem væsker kan altså have en meget kraftig påvirkning på fordelingen.

Et andet fænomen, der har indvirkning på fordelingen, er kompleksbindere. Man kan både forestille sig en kompleksbinding af lægemiddelstoffet i den lipofile samt i den hydrofile fase. Cellemembraner og andre lipofile barrierer har i reglen en heterogen sammensætning, hvor specifikke vekselvirkninger (kompleksbinding) i membranen spiller en rolle for lægemiddelstoftransporten. Vi har anvendt den elektrokemiske teknik til at måle vekselvirkningen mellem cholesterol opløst i 1,2-DCE og en serie lægemiddelstoffer. Resultaterne viste bl.a., at fordelingen af LidH⁺ ind i 1,2-DCE øges i tilstedeværelse af cholesterol, mens fordelingen af Lid ikke påvirkes af cholesterol. På lignende vis har vi studeret, hvordan en kompleksbinder i vandfasen påvirker fordelingen. Som eksempel på en vandopløselig kompleksbinder valgte vi α-cyklodextrin, som har en cyklisk struktur sammensat af 6 glukosemolekyler. Cyklodextriner anvendes bl.a. som tilsætningsstoffer i lægemidler. Deres særlige struktur betyder, at de kan kompleksbinde organiske molekyler; styrken af kompleksbindingen er bl.a. afhængig af molekylets størrelse. For α-cyklodextrin kunne vi også observere en effekt på lægemiddelstoffets fordeling og dermed få en ide om effekten af α-cyklodextrin som tilsætningsstof i lægemidler.

Der arbejdes i øjeblikket på at videreudvikle metoden, så den kan anvendes til særligt små prøvemængder og til detektion af ladede lægemiddelstoffer. Strømmen svarende til overførslen af et ladet lægemiddelstof er nemlig direkte proportional med koncentrationen af lægemiddelstoffet. Vi har været i stand til at kvantifisere meget små koncentrationer af lægemiddelstof (nM), så metoden kan konkurrere med andre følsomme detektionsprincipper baseret på massespektrometri eller fluorescens.