En ny receptor i mennesket
Med udgangspunkt i det humane genom er det lykkedes at identificere og karakterisere en ukendt receptor, som findes i de fleste af kroppens organer. Receptoren er efter alt at dømme biologisk vigtig og kan derfor være farmakologisk interessant.
Af Petrine Wellendorph, Anders Balsgaard, Kasper Bø Hansen og Hans Bräuner-Osborne.
Fra Lægemiddelforskning 2004
Kortlægningen af menneskets totale arvemateriale - det humane genom - blev afsluttet i 2001, og man vurderer, at vi har omkring 30.000 gener fordelt på 23 kromosompar. En stor del af generne er stadig ukendte, og man ved ikke, hvilken funktion de har i den menneskelige organisme.
Derfor er der et stort ønske om at identificere nye og ukendte gener i genomet for at undersøge genernes biologiske funktioner. Gener, der koder for receptorer på overfladen af celler, er særligt interessante ud fra et lægemiddelsynspunkt, fordi receptorerne kan binde hormoner eller signalstoffer på cellens yderside og starte signalkaskader inde i cellen. En lang række kendte lægemiddelstoffer virker netop ved at aktivere eller hæmme receptorer. På den måde kontrollerer medicinen cellens aktivitet og dermed de signaler, som cellen udsender til nabocellerne.
Et detaljeret kendskab til receptorers funktion er en forudsætning for udvikling af nye lægemidler. I vores projekt har vi med udgangspunkt i kendte receptorers aminosyresekvenser draget nytte af bioinformatik og udført databasesøgninger for at identificere ukendte receptorgener og bruge dem til at danne og karakterisere de receptorer, som generne koder for.
Cellernes omstillingsbord
G-protein koblede receptorer fungerer som omstillingsborde mellem cellers ydre og indre miljø. Receptorerne sidder indlejret i cellemembraner og kommunikerer med G-proteiner inde i cellerne. Når receptorerne stimuleres af et hormon, et signalstof eller et lægemiddelstof, startes en signalkaskade i cellen. G-protein koblede receptorer udgør målmolekylerne for henimod 30 procent af alle markedsførte lægemidler.
Receptorerne består af tre strukturelle byggeklodser:
- En ekstracellulær aminoterminal ende, som hormoner og signalstoffer kan binde sig til.
- Syv transmembrane dele forbundet af intracellulære og ekstracellulære slynger, som fastholder proteinet i cellemembranen og formidler kobling til G-proteinet.
- En intracellulær carboxyterminal ende.
Gen for ukendt receptor
Med udgangspunkt i medlemmer af den familie af receptorer, der kaldes G-protein koblede receptorer, har vi søgt på internettet i offentligt tilgængelige databaser over det humane genom (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), og her lykkedes det at identificere et gen med en hidtil ukendt funktion. Da genet har sekvensmæssig og strukturel lighed med en mindre familie af de G-protein koblede receptorer, kaldet familie C, har genet fået navnet GPRC6A for G-protein koblet receptor, familie C, subtype 6A.
- Udbredelsen af GPRC6A i forskellige organer i mennesket.
Næste trin var at lave en molekylær kloning af GPRC6A. Molekylær kloning går ud på at producere den DNA streng, der i organismen koder for et givet protein. Det klonede DNA kan nu indføres i eksperimentelle cellesystemer, hvor genet vil blive oversat til et protein. Derpå kan funktionen af proteinet studeres i laboratoriet ved at tilføre cellerne stoffer med en formodet virkning på proteinet. Før den egentlige molekylære kloning af GPRC6A i laboratoriet var det vigtigt først at forudsige størrelsen af genet samt få en ide om, hvilke organer der udtrykker genet. Derfor indhentede vi informationer fra databaser på internetet, og det er lykkedes os i laboratoriet at syntetisere en kopi af det stykke DNA, der koder for GPRC6A fra humant nyrevæv. Sekvensen af det syntetiserede DNA stemmer fuldstændig overens med den forudsagte sekvens fra genomet.
GPRC6A findes ikke blot i nyrerne, men også i mange andre af menneskets organer som f.eks. hjernen, lungerne, leveren, tarmene og musklerne. Dét tyder stærkt på, at receptoren må være biologisk vigtig.
Karakterisering af GPRC6A
For at undersøge funktionen af en receptor benytter man sig af simple, opdyrkede pattedyrsceller, som tilføres det klonede DNA og derfor er i stand til at producere det tilsvarende protein.
Hvis man er heldig, bliver receptorproteinet straks indlejret i cellernes ydre membran og vil så kunne påvirkes eksperimentelt med stoffer, man tror kan binde til receptoren og aktivere den.
Ved at mærke proteinet med et specifikt antistof observerede vi desværre, at GPRC6A ikke umiddelbart udtrykkes på overfladen af de primitive celler, men forbliver inde i cellerne. Det kan skyldes, at GPRC6A fysiologisk set ikke er en overfladereceptor, eller at den tilbageholdes i cellerne af andre årsager.
Kimære receptorer viser vejen
Med henblik på at "tvinge" human GPRC6A op til celleoverfladen konstruerede vi blandingsprodukter - såkaldte kimærer - mellem GPRC6A og en beslægtet receptor fra sanseorganerne på guldfisk.
Vi har produceret kimærer, hvor enten den aminoterminale del eller den transmembrane plus carboxyterminale del af GPRC6A er udskiftet med de tilsvarende komponenter fra guldfiskereceptoren. En af de fremstillede kimærer blev transporteret til celleoverfladen.
Den kunstigt fremstillede receptor har hjulpet os til at trække den del af GPRC6A op til overfladen, som indeholder bindingsdomænet, og det gør det muligt at afdække, hvilke stoffer der genkendes af receptoren. Identifikation af stoffer, der binder til GPRC6A, er af stor betydning for i fremtiden at kunne udvikle lægemidler rettet mod netop denne receptor.
Binding til GPRC6A
- Receptorer udtrykt i cellemembranerne i en pattedyrcellelinie vist med antistofmærkning.
- Proteinet for den kimære receptor er udtrykt i den ydre membran af celler; her vist ved mærkning med et fluorescerende antistof.
Den kimære receptor indeholder, foruden bindingsdomænet af GPRC6A, det transmembrane signaldomæne fra guldfiskereceptoren. Man ved fra tidligere forsøg, at signaldomænet kan aktivere kloridkanaler i ægceller fra en afrikansk frø, Xenopus laevis, og derfor har vi benyttet dette system til at screene stoffer på GPRC6A. Når genet for guldfiskereceptoren indsprøjtes i ægcellen, udtrykkes proteinet på ægcellens overflade, og det samme er tilfældet med den kimære receptor.
Forsøgene viste, at to naturligt forekommende aminosyrer, arginin og lysin, kan binde sig til kimærreceptoren og føre til åbning af kloridkanalerne. Til sammenligning giver ægceller uden kimærreceptoren intet signal. Arginin og lysin er således indirekte blevet vist at være stoffer, der kan binde sig til GPRC6A. Vi har efterfølgende testet andre aminosyrer og fundet, at ornitin, citrullin, alanin, glycin og serin også kan binde sig til GPRC6A.
Receptoren i andre pattedyr
For at undersøge farmakologien af GPRC6A yderligere har vi klonet en tilsvarende receptor fra mus, som er identisk med den humane receptor på 80 procent af aminosyrerne. I modsætning til GPRC6A udtrykkes musereceptoren på overfladen af pattedyrcellerne. Ved at sammenligne GPRC6A i menneske og mus håber vi at kunne sandsynliggøre, hvilke dele af den humane receptor, der hindrer dens transport til celleoverfladen. Desuden har vi udtrykt musereceptoren i ægceller og har også her kunnet vise, at arginin virker aktiverende.
Vi ved nu, at GPRC6A er en receptor for aminosyrer i flere pattedyr, og det styrker troen på, at receptoren er biologisk vigtig. Da aminosyrer findes naturligt i organismen og har stor betydning i både proteinsyntesen og stofskiftet, kan det tænkes, at GPRC6A spiller en vigtig rolle i såvel den raske som den syge organisme.
Vort projekt tjener i et større perspektiv til at bane vejen for en detaljeret opklaring af GPRC6A's biologiske rolle i sundhed og sygdom - og som potentielt mål for udvikling af nye lægemidler.
