Fluorescens viser farmakologi!
Tidligere måtte man bruge mange forskellige testsystemer for at opklare de farmakologiske egenskaber af nye lægemiddelstoffer. Nu kan tests baseret på fluorescens give svaret, selv om de proteiner, stofferne skal påvirke, fungerer vidt forskelligt.
Af Mette Strange og Hans Bräuner-Osborne.
Fra Lægemiddelforskning 2003
Mange molekyler exiteres af lys med en bestemt bølgelængde, hvilket får dem til at udsende lys ved en anden bølgelængde; molekylerne fluorescerer. I medicinsk forskning har brugen af fluorescens i de seneste år revolutioneret mulighederne for at bruge cellekulturer til at teste, hvordan nye lægemiddelstoffer vil påvirke deres mål i kroppen.
Undersøgelserne kan f.eks. foregå ved hjælp af et NOVOstar? apparat, som Institut for Medicinalkemi for nylig har anskaffet og brugt til farmakologiske undersøgelser af lægemiddelstoffer, som er rettet mod proteiner i cellemembranerne.
Netop membranbundne proteiner er centrale for sundhed og sygdom, fordi de spiller en stjernerolle i cellernes indbyrdes kommunikation, hvor de udgør forbindelsesledet mellem det ydre miljø i vævene og cellernes indre. De fleste af nutidens lægemidler virker ved at binde sig til membranproteiner.
Receptorer og transportører
- Princippet i fluorescens. Et molekyle exiteres, når det belyses med én bestemt bølgelængde (λex), hvorefter molekylet udsender fluorescerede lys med en anden bølgelængde (λem).
Mange membranproteiner er receptorer for naturlige signalstoffer og hormoner. Receptorerne fungerer som omstillingsborde mellem omgivelserne og cellens indre. Når et signalstof bindes til receptoren, udløser det et meget specifikt respons inde i cellen.
En vigtig gruppe receptorer er G-proteinkoblede receptorer. Når de aktiveres af et signalstof, stimuleres forskellige intracellulære enzymer, hvilket kan føre til frigivelse af positivt ladede calciumioner fra cellens interne depoter.
En anden vigtig receptortype indeholder ionkanaler. Når de aktiveres, løber en strøm af ioner gennem receptoren. Strømmen påvirker cellens membranpotentiale, dvs. spændingsforskellen over membranen. I en hvilende celle er ydersiden og indersiden af membranen henholdsvis positivt og negativt ladet. En indadrettet strøm af positivt ladede ioner reducerer cellens membranpotentiale, hvorimod indstrømning af negativt ladede ioner øger membranpotentialet.
Tilstedeværelsen af signalstoffer mellem cellerne skaber en vedvarende stimulation af receptorerne, som med tiden ville overbelaste cellens indre maskineri, hvis ikke overbelastningen blev forebygget af cellens skraldemænd. Det er transportørerne, en gruppe membranproteiner, som fragter signalstoffer ind gennem membranen til cellens indre, hvor de ikke længere kan aktivere receptorerne.
Lægemiddelstoffer, der binder sig til receptorer, kan enten efterligne effekten af et naturligt signalstof og aktivere receptoren, eller de kan virke som en prop i receptoren og blokere effekten af signalstoffet. På samme måde kan stoffer, som binder sig til transportører, enten blive sendt ind i cellen eller blokere for transport af signalstoffet til cellens indre.
Fokus på glutaminsyre
- Det nye NOVOstar? apparat, som anvendes til studierne på Institut for Medicinalkemi.
Vi har sat fokus på samspillet mellem glutaminsyre og receptorer og transportører. Glutaminsyre er det vigtigste stimulerende signalstof i centralnervesystemet. Men når mængderne af signalstoffet er for store, kan det føre til nervedød. Lægemiddelstoffer, som regulerer niveauet af glutaminsyre i hjernen, er farmakologisk interessante i forbindelse med udvikling af behandlinger mod bl.a. Alzheimers sygdom.
Glutaminsyre udøver sin fysiologiske effekt via såvel G-proteinkoblede receptorer som ionkanalreceptorer. Når glutaminsyre har stimuleret receptorerne, fjernes signalstoffet af transportører.
Flere fluer med ét smæk
Vi har brugt de nye testsystemer til at måle glutaminsyres effekt på alle tre typer membranproteiner. I calciumtesten forårsager stigende koncentrationer af glutaminsyre en stigning i den målte fluorescens både i celler, der udtrykker den G-protein-koblede receptor mGluR1 og ionkanalreceptoren iGluR5. Selvom den øgede mængde af intracellulært calcium opstår via to vidt forskellige cellulære processer, kan de to receptortyper altså karakteriseres farmakologisk i samme testsystem.
Eftersom indstrømningen af positive calciumioner gennem iGluR5 påvirker cellens membranpotentiale, kan denne receptor også testes i membranpotentialetesten, som ligeledes kan karakterisere transportøren EAAT2.
For hvert glutaminsyremolekyle, som transportøren sender ind i cellen, lukker den tre positive natriumioner og en proton ind, mens kun én positiv kaliumion tranporteres den modsatte vej. Den totale indvirkning på cellens membranpotentiale ved aktiv transport af glutaminsyre er derfor en reduktion af spændingen over cellemembranen. Transporten af glutaminsyre giver således anledning til en stigende fluorescens i membranpotentialetesten.
Databehandlingen af fluorescenssignalet i de to testsystemer er såre enkel. Det maksimale respons opnået ved forskellige koncentrationer af glutaminsyre og andre stoffer, som stimulerer receptorer og transportører, kan konverteres til koncentrationsresponskurver. På samme måde kan virkningen af blokerende stoffer udledes af deres evne til at hæmme effekten af en bestemt koncentration af glutaminsyre.
Ud fra fluorescenssignaler af varierende intensitet er det derfor nu muligt at vurdere, om et potentielt lægemiddelstof har stimulerende eller blokerende virkninger på en given receptor eller transportør, samt hvor potent stoffet er.
- Figuren viser princippet i fluorescensbaserede test af, hvordan signalstoffet glutaminsyre påvirker membranproteiner, der fungerer som receptorer og transportører. Til venstre en G-protein-koblet receptor (mGluR1). I midten en ionkanalreceptor (iGluR5) og til højre en transportør (EAAT2). Systemet kan bruges til at undersøge stimulerende og blokerende virkninger af potentielle lægemiddelstoffer.
Vi har i den seneste tid implementeret to fluorescensbaserede testsystemer. I begge systemer anvendes plader dækket med celler, der udtrykker forskellige receptorer og transportører.
Det ene system - calciumtesten - bruges til at måle, hvordan signalstoffer og lægemiddelstoffer påvirker de typer af G-proteinkoblede receptorer, der medfører frigivelse af positive calciumioner fra depoter i cellen. Systemet er baseret på et molekyle, der kan trænge gennem cellemembranen og binde sig til calciumionerne. Ved dannelsen af komplekset bliver molekylet fluorescerende. Ionkanalreceptorer, som tillader indstrømning af positive calciumioner i cellen, kan ligeledes karakteriseres med systemet, fordi det nytilkomne calcium skaber øget fluorescens i cellens indre.
Det andet system - membranpotentialetesten - måler de ændringer i spændingen over cellemembranen, som opstår ved åbning af ionkanaler. Her benyttes et andet molekyle, som fluorescerer, når det binder sig til intracellulære proteiner. Molekylet er negativt ladet, hvorfor dets evne til at trænge ind i cellerne bestemmes af cellens membranpotentiale.
Når spændingen over cellemembranen er høj, frastøder membranen molekylet, og indstrømningen begrænses. Når spændingen er lav, øges indstrømningen. Jo større mængder af molekylet, der strømmer ind i cellen og bindes til intracellulære proteiner, jo stærkere bliver fluorescensen.
Og nu med automatisering...
Tidligere måtte man bruge et væld af forskellige metoder for at bestemme de farmakologiske egenskaber af nye lægemiddelstoffer.
Men takket være introduktionen af fluorescensbaserede testsystemer i lægemiddelforskningen kan farmakologien af nye stoffer nu bestemmes i ganske få tests - også selvom målproteinerne på molekylært plan fungerer endog meget forskelligt.
Simpliciteten af de nye metoder har endda muliggjort en høj grad af automatisering, hvilket har betydet, at en anseelig mængde stoffer kan afprøves på mange målproteiner inden for en overskuelig tidsramme. Test af store biblioteker af strukturelt vidt forskellige stoffer mod terapeutisk interessante proteiner er nu blevet en essentiel del af moderne lægemiddelforskning.
