Fra svampegift til potentielt lægemiddel med ny virkning

Muscimol fra rød fluesvamp forårsager de alvorlige psykiske forstyrrelser, som kan optræde hos mennesker, der har indtaget den tørrede svamp. I et mangeårigt projekt har vi tæmmet giftstoffet til forbindelsen THIP, som i kliniske forsøg viser en helt ny farmakologisk profil, som kan føre til udvikling af nye sovemidler og smertestillende lægemidler.

Af Povl Krogsgaard-Larsen og Lotte Brehm
Fra Lægemiddelforskning 2001

Den røde fluesvamp, Amanita muscaria, danner flere strukturelt særegne stoffer, hvoraf nogle påvirker det perifere nervesystem, mens andre udøver deres effekt på centralnervesystemet, dvs. hjernen og rygmarven. Stofferne kan forgifte både mennesker og dyr, og denne toksicitet afspejler, at stofferne påvirker vitale fysiologiske mekanismer.

De mest kendte af fluesvampens gifte er muscarin og muscimol. Muscarin aktiverer de muscarine receptorer, som bl.a. forekommer i hjertemuskulaturen, hvilket er årsag til den dødbringende effekt ved indtagelse af større mængder af den tørrede fluesvamp.

Smuk, men farlig - den røde fluesvamp, Amanita muscaria. Når den tørrede svamp indtages i større mængder kan indholds-stofferne forårsage død-bringende uregelmæssigheder i hjertefunktionen og alvorlige psykotiske forstyrrelser.

I modsætning til muscarin trænger muscimol gennem blodhjerne- barrieren og aktiverer GABA-receptorerne på hjernens nerveceller meget kraftigt. GABA er hjernens vigtigste hæmmende signalstof. De alvorlige psykiske forstyrrelser, som ses hos mennesker, der indtager den tørrede fluesvamp, skyldes primært muscimols effekt på GABA-systemet.

Denne artikel beskriver et mangeårigt projekt, hvor vi har tæmmet giften muscimol til det lovende lægemiddelstof THIP, som i kliniske forsøg viser en helt ny farmakologisk profil.

Muscimol som modelstof

Muscimol har som nævnt en kraftig stimulerende effekt på hjernens GABA-receptorer. Muscimols aktivering af receptorerne er væsentlig stærkere end GABA's egen, og toksiciteten skyldes sandsynligvis, at muscimol bindes for kraftigt til GABA-receptorerne og dermed på en måde sætter dem ud af spillet. Toksiciteten kan også til dels skyldes, at muscimol bliver omdannet til andre giftige forbindelser af enzymer i hjernen og i øvrigt påvirker andre funktioner i GABA-signalsystemet.

Ikke desto mindre er muscimol et interessant medicinalkemisk modelstof for udvikling af lægemidler til behandling af sygdomme, som skyldes ubalance i GABA-systemet, og som muligvis kan afhjælpes gennem påvirkning af GABA-receptorerne. Spørgsmålet var fra starten, om vi kunne tæmme effekten af muscimol og omdanne dette særegne stof til et lægemiddel med en ønsket og kontrolleret virkning.

I den første fase af projektet opstillede vi en hypotese vedrørende muscimols kraftige stimulerende virkning på GABAreceptorerne. Hypotesen blev fremsat på et tidspunkt, hvor vi intet vidste om GABA-receptorernes struktur og funktion. Muscimol har på grund af det indbyggede ringsystem en langt mere fastlåst struktur end GABA; kun molekylets sidekæde kan drejes. Muscimol kan indtage to konformationer, som i følge hypotesen muliggør en trinvis binding, hvorved stoffet tilpasser sig receptoren. Først bindes muscimol til receptoren, hvorefter der sker en konformationsændring fra den relativt stabile konformation I til den mindre favorable konformation II. Efter bindingen til receptoren forestillede vi os, at muscimolmolekylet med hjælp fra receptoren igen ville ændre konformation henimod den mere stabile konformation I, og at den herved frigjorte energi var tilstrækkelig til at aktivere receptoren.

Fra gift til lægemiddelstof

Figuren viser to konformationer af giftstoffet muscimol, I og II, samt strukturen af det potentielle lægemiddelstof THIP. Alle tre stoffer binder sig til GABA-receptorer på hjernens nerveceller.
Muscimol aktiverer GABA-receptorer 100 procent og skifter muligvis mellem de to konformationer under bindingen til receptoren. THIP aktiverer GABA-receptorer langt mere skånsomt. Stoffet er en såkaldt partiel GABA-agonist. THIP er således en tæmmet udgave af muscimol - et potentielt og lovende lægemiddelstof.

Syntese af THIP

Fremstillingen af THIP sker gennem en syntese med mange trin, som er skitseret i figuren. Strategien har været at opbygge 6-ringen i THIP og derefter at opbygge funktionelle grupper på ringen, hvilket muliggjorde tilbygningen af 5- ringen. Som vist indeholder udgangsstoffet A kun et af de kulstofatomer, der kommer til at indgå i GABA-delen af THIP. Gennem seks syntesetrin omdannes A til B, som nu indeholder alle de fire kulstofatomer, som kommer til at udgøre GABA-delen i målmolekylet. Gennem to yderligere trin omdannes grupper på ringen af B til grupper på C, som muliggør cyklisering til den bicykliske ringstruktur. Det kræver 3 syntesetrin at omdanne C til THIP.

For at underbygge denne hypotese blev stoffet THIP syntetiseret som modelstof. I THIP er muscimol fastlåst i den ufavo- rable konformation II, som vi mente muscimol kunne antage i forbindelse med bindingen til GABA-receptoren. På grund af den fastlåste konformation mente vi, at THIP nok ville binde sig til receptoren, men måske ikke være i stand til at aktivere den.

Det blev vist, at THIP binder effektivt til GABA-receptoren om end ikke helt så kraftigt som muscimol. Men til vores overraskelse viste det sig, at THIP også i høj grad var i stand til at aktivere receptoren. Det betød, at den del af hypotesen, der vedrørte selve aktiveringsmekanismen, var forkert. Det kunne altså ikke alene være frigjort energi ved muscimolmolekylets ændring af konformation fra II til I, som aktiverer receptoren. Hvilken mekanisme, der aktiverer GABA-receptoren, er i dag, mange år senere, fortsat uafklaret.

Men det skulle vise sig, at vi havde fundet det helt rigtige stof, omend af den forkerte grund. Gennem flere års studier er det nu blevet klarlagt, at THIP i modsætning til muscimol specifikt stimulerer GABA-receptorer og kun dem. Og mens muscimol aktiverer receptorerne 100 procent, gør THIP det på en langt mere skånsom og afdæmpet måde.

Det var lykkedes at tæmme muscimol, og efter omfattende studier af THIP tonede konturerne af et nyt lægemiddelstof frem.

Fluesvampens giftstoffer

 

De vigtigste farmakologisk aktive indholdsstoffer i den røde fluesvamp er muscarin, ibotensyre og muscimol. I den øverste figur illustreres den strukturelle lighed mellem ibotensyre og muscimol og hjernens signalstoffer glutaminsyre og GABA.

Stoffet muscarin er i stand til at aktivere den undergruppe af receptorer for signalstoffet acetylcholin, der betegnes muscarine receptorer. Muscarin indeholder en permanent positiv ladning. Stoffet kan derfor ikke trænge gennem den fedtholdige blod-hjerne-barriere, som adskiller blodbanen fra hjernevævet. Muscarin aktiverer derfor kun de muscarine receptorer i det perifere nervesystem, bl.a. i hjertemuskulaturen. Det er primært denne effekt, der ligger til grund for alvorlige forgiftninger, eventuelt med dødeligt forløb efter indtagelse af større mængder af tørret fluesvamp. Fluesvampen biosyntetiserer også aminosyren ibotensyre, som indeholder en 3-hydroxyisoxazolgruppe. Hydroxygruppen på isoxazolringen har sur karakter af omtrent samme styrke som en carboxylgruppe. Ibotensyre er således en strukturanalog af glutaminsyre med 3-hydroxyisoxazolgruppen i stedet for glutaminsyrens carboxylgruppe. Denne strukturelle lighed kan ligge til grund for, at ibotensyre er i stand til at aktivere receptorerne for signalstoffet glutaminsyre. Den tørrede fluesvamp indeholder også stoffet muscimol, som strukturelt ligner signalstoffet GABA. Svampen biosyntetiserer ikke muscimol; men under tørringsprocessen taber ibotensyre sin carboxylgruppe under fraspaltning af kuldioxid, og bliver derved til muscimol. I de områder i verden, hvor fluesvampen anvendes som rusmiddel, er det den tørrede svamp, der indtages. Effekten på centralnervesystemet skyldes primært indholdet af muscimol. De forvirringstilstande - og efter indtagelse af større mængder tørret svamp - psykotiske forstyrrelser, der karakteriserer rusen, er primært resultatet af, at muscimol meget kraftigt aktiverer hjernens receptorer for signalstoffet GABA.

Ibotensyre er toksisk over for flere lavere dyrearter bl.a. fluer. Det er næppe ibotensyren selv, der dræber fluerne, idet flere analoger af glutaminsyre, som påvirker receptorerne for glutaminsyre endnu kraftigere end ibotensyre, ikke er toksiske over for fluer. Alle dyrearter har receptorer for GABA, og den toksiske effekt skyldes efter al sandsynlighed, at ibotensyre i dyrene omdannes til muscimol, som påvirker GABA-receptorerne.

Fraspaltningen af carboxylgruppen i ibotensyre katalyseres af enzymet GAD, som i alle organismer katalyserer dannelsen af GABA ud fra glutaminsyre. Meget tyder altså på, at fluesvampen har fundet det hensigtsmæssigt at danne ibotensyre som transportform af muscimol som forsvar mod forskellige arter af dyr. En anden funktion af ibotensyre er i øvrigt at udgøre en strukturel komponent af svampens røde farvestof.

Strukturen af ibotensyre og muscimol er entydigt fastlagt ved røntgenkrystallografiske analyser. Strukturen af begge stoffer er enestående, og der findes ikke andre naturstoffer, som indeholder den sure 3- hydroxyisoxazol-ringstruktur. Den nederste del af figuren viser strukturen af ibotensyre og muscimol.

THIP i kliniske undersøgelser

Ønsker man at trænge ind på nye farmakologiske og terapeutiske områder, er det selvsagt nødvendigt med nye stoffer, der hverken kan købes eller på anden måde erhverves. De må syntetiseres, og i mange tilfælde er synteserne vanskelige og særdeles tidsrøvende. Det gælder også for THIP. Det tog mere end et år at syntetisere de første 50 mg af stoffet og yderligere adskillige måneder, før metoden var videreudviklet til at fremstille THIP i gramskala. H. Lundbeck A/S har nu stoffet i udvikling og har efter års intens forskning formået at udbygge syntesemetoden til produktion af THIP i stor skala.

Tilsammen har alle disse forhold banet vejen for kliniske forsøg med THIP. Undersøgelser i patienter har vist, at THIP besidder meget kraftig smertestillende effekt. Det skelsættende i denne sammenhæng er, at THIP's smertestillende effekt er helt uafhængig af hjernens opiatsystem - det system, der medierer morfins effekt på smerter. Vi står altså med et nyt smertestillende stof, hvis effekt ikke ledsages af morfinpræparaternes bivirkningsmønster. Dertil kommer, at det i de seneste år er blevet vist, at THIP har meget interessante effekter på søvnmekanismerne i mennesker. Det er en spændende kombination af kliniske effekter.

Det foreliggende projekt er et mangeårigt samarbejdsprojekt mellem forskere på Institut for Medicinalkemi, DFH og firmaet H. Lundbeck A/S.

Gennem blod-hjerne-barrieren

THIP, og i øvrigt også muscimol, er i modsætning til signalstoffet GABA i stand til at trænge gennem blod-hjerne-barrieren. GABA-molekylet er næsten 100 procent elektrisk ladet, og på grund af denne ladede struktur er GABA ikke i stand til at trænge gennem blod-hjerne-barrieren. Ligesom GABA er både muscimol og THIP elektrisk ladede, men for begge disse stoffer gælder det, at omkring 0,1 procent af molekylerne i vandig opløsning foreligger i uladet form. Den uladede form kan trænge gennem blod-hjerne-barrieren. Inde i hjernevævet, på den anden side af barrieren, indstiller ligevægten sig igen med 99,9 procent af stoffet THIP i elektrisk ladet form, og det er denne form, der binder til og aktiverer GABA-receptorerne. Mere præcist er det en undergruppe af GABA-receptorer, GABAA, der aktiveres af muscimol og THIP.
I modsætning til muscimol viser THIP meget ringe toksicitet i dyr og mennesker. Dette forhold skyldes muligvis i nogen grad, at aminogruppen (NH-gruppen) i THIP er indbygget i en ring og dermed beskyttet mod den enzymatiske proces, der nedbryder sidekæden i muscimol.

Røntgenstruktur af THIP

THIP er et nyt potentielt lægemiddel, som viser en spændende farmakologisk profil og en bemærkelsesværdig specificitet. Stoffet har kun effekt på GABAA-receptorerne. Der er syntetiseret en mangfoldighed af strukturelt beslægtede forbindelser, men ingen af dem evner at aktivere GABAA-receptorerne. THIP er således en enestående forbindelse.
THIP er et meget fastlåst molekyle. Det betyder, at den struktur af THIP, der er blevet bestemt ved en røntgen-krystallografisk analyse, må formodes at illustrere THIP i den form, der bindes til og aktiverer GABAA-receptorerne. Første trin i analysen er at dyrke krystaller af THIP. Krystallen anbringes i en intens røntgenstråle, som spredes af atomerne i krystallen. Den spredte stråling danner et mønster, og ud fra spredningsmønstret kan man entydigt beregne den tredimensionelle atomare struktur af THIP.

Det Farmaceutiske Fakultet
Topgrafik

Københavns Universitet
School of Pharmaceutical Sciences
Universitetsparken 2
2100 København Ø
CVR: 29 97 98 12

Tlf. +45 35 33 60 00
Fax 35 33 60 01
Mail pharmaschool@sund.ku.dk
Web pharmaschool.ku.dk