Hvad har varme at gøre med lægemidler?
Når et lægemiddelstof binder til en receptor i kroppen, opstår der uhyre små varmeændringer. varmeændringerne viser, hvor godt og hvordan stoffet binder til receptoren. Det er meget nyttig viden ved udvikling af nye lægemidler.
Af Lars Olsen, Christina Kasper, Jette Sandholm Kastrup, Michael Gajhede og Flemming Steen Jørgensen
Fra Lægemiddelforskning 2006
En første forudsætning for, at et molekyle kan fungere som et lægemiddel, er som regel, at det kan binde til et af kroppens egne molekyler eller til molekyler i sygdomsfremkaldende bakterier eller vira. Et eksempel kan være, at lægemiddelstoffet binder sig til et enzym og hæmmer enzymets evne til at katalysere en kemisk reaktion, som man ønsker at påvirke i en sygdomsbehandling. Derfor er det helt afgørende i udviklingen af nye lægemidler at have gode mål for, hvor effektivt et stof binder sig til sit målmolekyle.
Man kan få præcise oplysninger om bindingens styrke ved at måle de uhyre små varmeændringer, som finder sted, når molekyler vekselvirker med hinanden. Med et fagudtryk skal man bestemme ændringen af Gibbs frie energi for bindingsreaktionen.
Bindingen karakteriseres
Inden for lægemiddelforskningen anvendes mange forskellige metoder til at bestemme den frie energi ved molekylære vekselvirkninger. En af dem kaldes ITC – Isothermal Titration Calorimetry. ITC kan bestemme uhyre små varmeændringer helt ned til mikrokalorier, hvilket svarer til ændringen i temperaturen på en milliontedel af en grad. Samme temperaturændring ville man observere, hvis man opløste en teskefuld sukker i 5.000 liter kaffe. Der er altså tale om et særdeles fintfølende instrument.
Ud fra målinger af de meget små varmeændringer kan man bestemme, hvor godt lægemiddelstoffet binder til målmolekylet. Men det helt unikke ved metoden er, at den kan give yderligere oplysninger om mekanismen ved bindingen. Man kan bestemme, om den primære drivkraft er entalpi, som er et mål for ændringer i systemets indre energi, eller om den vigtigste mekanisme er entropi, som er et mål for graden af termodynamisk uorden, der opstår ved bindingen. Disse informationer er vigtige for os, fordi de fortæller os noget om, hvordan stoffet binder til sit målmolekyle.
Det er termodynamik!
Når et lægemiddelstof binder til et protein, vil styrken af bindingen afhænge af ændringen i Gibbs frie energi (ΔG), som kan relateres direkte til bindingskonstanten K (udtryk 1 nedenfor). En spontan proces har en negativ ΔG og medfører altså en stor bindingskonstant. Det unikke ved ITC er, at man udover ΔG også bestemmer ændringen i entalpi (ΔH) og dermed kan ændringen i entropi (ΔS) også bestemmes (udtryk 2 nedenfor).
1) Δg = – r·T·lnK,
(r er gaskonstanten, T er temperaturen)
2) Δg = Δh – T·Δs
Størrelsen og fortegnet af ΔH afhænger af de hydrogenbindinger, ion-ion eller van der Waals vekselvirkninger, der dannes mellem protein og stof, samt om der er en energetisk straf af sterisk karakter. En negativ ΔH betyder fx, at der dannes mere favorable hydrogenbindinger mellem stoffet og proteinet i forhold til de hydrogenbindinger, der var dannet mellem stoffet og opløsningsmidlet.
Størrelsen og fortegnet af ΔS afhænger af den orden, der er i systemet efter bindingen af lægemiddelstoffet til proteinet. ΔS afhænger bl.a. af den hydrofobe effekt eller af om bindinger i proteinet eller lægemiddelstoffet fastfryses ved bindingen. En positiv ΔS betyder, at der er mere uorden i systemet efter binding. Bemærk, at en positiv ΔS også betyder, at ΔG bliver mere negativ, og at bindingen altså styrkes.
I lægemiddelsammenhæng er det vigtigt, at bindingen er så stærk som muligt (dvs. så negativ ΔG som muligt). På figuren ovenfor ses, at man kan få en negativ ΔG ved forskellige kombinationer af størrelse og fortegn af ΔH og ΔS. I situation A vil bindingen være drevet af positiv og dermed favorabel ΔS, mens bindingen i situation B vil være domineret af en favorabel ΔH. C viser en situation, hvor både ΔH og ΔS bidrager til en god binding.
Generelt har det vist sig at være vigtigt at gøre ΔH så favorabel som muligt for at optimere komplementariteten mellem protein og ligand. For HIV-1 protease binder 1. generationshæmmerne med favorabel entropi (situation A), mens man for 2. generationshæmmerne har optimeret entalpien (situation C).
Det klassiske eksempel
Et klassisk eksempel på anvendelse af ITC stammer fra forskningen i HIV. Enzymet HIV-1-protease er helt nødvendigt for, at infektionen kan udvikle sig, så hvis man vil undgå, at en HIV-infektion udvikler sig til AIDS, er proteasen et godt mål for et lægemiddel. På basis af kendskabet til den tredimensionelle struktur af HIV-1-proteasen lykkedes det i 1990’erne at udvikle en lille håndfuld proteasehæmmere, som er nogle af de lægemidler, som anvendes til behandling af AIDS.
Træerne vokser jo som bekendt ikke ind i himlen, og det vis te sig da også hurtigt, at HIV udviklede resistens mod de første proteasehæmmere. Omkring år 2000 kunne man med ITC vise, at entropi var den dominerende grund til, at disse hæmmere bandt til proteasen. Ved at anvende ITC kombineret med strukturelle metoder kunne man nu udvikle den næste generation af proteasehæmmere, hvor binding i højere grad skyldes entalpibidrag fra dannelsen af hydrogenbindinger til enzymets skelet. Det har vist sig at være langt vanskeligere for HIV at udvikle resistens over for disse nye proteasehæmmere.
- Figuren viser den del af glutamat-receptoren GluR2, som binder signalstoffet glutaminsyre. Receptoren fastlåses i en åben form ved binding af lægemiddelstoffet NS-1209, der blokerer receptorens aktivitet; åbningen er vist med den buede pil. Ved binding af glutaminsyre lukker receptoren sig helt sammen om signalstoffet, hvorved receptoren aktiveres.
Forskning i glutamatreceptorer
I forskningsgruppen Biostrukturel Forskning på Danmarks Farmaceutiske Universitet er vi for nyligt begyndt at anvende ITC i arbejdet med ionotrope glutamatreceptorer. Disse receptorer påvirkes af glutaminsyre, der er hjernens vigtigste stimulerende signalstof, og receptorerne overaktiveres i en række sygdomme som fx epilepsi.
Vi har i 2006 sammen med medicinalfirmaet NeuroSearch A/S rapporteret et arbejde vedrørende stoffet NS-1209, hvori ITC indgår som en vigtig metode. NS-1209 er udviklet på NeuroSearch og er for tiden i klinisk afprøvning som et nyt lægemiddel mod epilepsi og mod kroniske nervesmerter. Stoffet blokerer for aktiviteten af glutamatreceptorerne. Ved at bestemme den tredimensionelle struktur af NS-1209 sammen med receptoren har vi lært, at stoffet fastlåser receptoren i en meget åben facon.
Det er velkendt, at lægemiddelstoffer med forskellig funktion ofte binder med forskellige fortegn af entalpi og entropi. For receptorer er det ofte sådan, at blokerende stoffer binder med favorabel entalpi, mens stimulerende stoffer, der aktiverer receptoren, binder med favorabel entropi. NS-1209 passer godt ind i dette billede, da dette blokerende stof binder med favorabel entalpi i forhold til det stimulerende signalstof glutaminsyre. Denne information er meget nyttig for det videre arbejde med disse receptorer med henblik på at udvikle nye lægemidler.
ITC måler meget små varmeændringer
De viste data svarer til et typisk ITC-eksperiment:
Sprøjte og celle er fyldt med henholdsvis 250 μL lægemiddelstof (grøn) og 1,4 mL protein (rød). Til bestemte tider tilsættes en smule af lægemiddelstoffet til cellen med protein. Hvis stoffet binder til proteinet, sker der en varmeændring.
I et ITC-eksperiment måles den elektriske effekt, der skal til for at holde temperaturen konstant i cellen, efter at lægemiddelstoffet er blevet tilsat. Ved at tilsætte stof gentagne gange vil alle proteinmolekylerne til sidst have bundet stof. Dette observeres ved, at den elektriske effekt aftager, som det ses på den øverste figur.
Arealet under kurven giver den varme, der er forbundet med processen, hvilket er vist i den nederste figur. Ud fra dette areal kan en bindingskonstant, støkiometri af stof i forhold til protein, entalpi (ΔH) og entropi (ΔS) bestemmes.
