Kan peptider hjælpe lægemiddelstoffer ind i cellen?
De fleste lægemidler virker kun, hvis lægemiddelstoffet optages i menneskets celler. Men desværre er optaget ofte utilstrækkeligt, især når lægemiddelstoffet består af store, vandopløselige molekyler som peptider, proteiner, DNA eller RNA. En løsning kan være at bruge membranpenetrerende peptider til at fragte medicinen ind i cellerne.
Biologiske molekyler som peptider, proteiner, DNA og RNA har et stort potentiale til sygdomsbehandling, men ofte er det svært at få lægemiddelstofferne transporteret ind i de celler, hvor medicinen skal virke. Derfor vakte en artikel i det anerkendte tidsskrift Science stor opsigt i 1999. Studiet viste nemlig, at når man gav mus et stort protein sammen med et membranpenetrerende peptid, fandtes proteinet kort tid efter overalt i musens celler. Resultatet var specielt interessant, fordi peptidet ikke så ud til at give bivirkninger eller være giftigt. Siden dengang er der for alvor kommet fokus på muligheden for at anvende membranpenetrerende peptider ved formulering af lægemidler.
Membranpenetrerende peptider er ofte relativt korte sekvenser med 20-30 aminosyrer. De er i stand til at trænge igennem biologiske membraner og i mange tilfælde kan peptidet medtage et andet og større molekyle - f.eks. et lægemiddelstof - uden at medføre toksiske bivirkninger. Det har været svært at kortlægge virkningsmekanismerne, men det ser bestemt ud til, at membranpenetrerende peptider udnytter attraktive principper, som bør undersøges nærmere. Ved en række studier af naturlige og syntetiske peptider har man fundet, at en positiv ladning af peptidet er vigtig. Desuden ser effekten i nogen grad ud til at være uafhængig af celletypen samt af størrelsen på den last, som peptidet skal bringe ind i cellen.
Makromolekyler og lægemiddelstoffer
Peptider, proteiner og oligonukleotider er biomakromolekyler; nogle eksempler er væksthormon, insulin og RNA. De to førstnævnte stoffer administreres i dag ved gentagne injektioner, fordi de ikke er stabile nok og ikke optages tilstrækkeligt let i cellerne til at kunne indgives i tabletter. Mulig terapi med f.eks. siRNA er også betinget af, at stoffet optages i cellerne.
Virkningsmekanismen
- Store vandopløselige lægemiddelstoffer (røde ovaler) er ofte ude af stand til at trænge ind i celler; i nogle tilfælde sker det dog via endocytose. Optaget kan forbedres (A) ved administration sammen med membranpenetrerende peptid (grønne streger). Først bindes peptidet til cellemembranen (B), hvorpå komplekset optages via endocytose (C). Til sidst frigives peptidet og lægemiddelstoffet hver for sig fra indposningen (D)- et vigtigt trin for at lægemiddelstoffet kan virke i cellen.
Uden et membranpenetrerende peptid til at bane vejen optages store, vandopløselige lægemiddelstoffer oftest slet ikke i celler, hvilket normalt gør stofferne virkningsløse. Dog sker optagelse af og til ved endocytose, hvor cellemembranen krænges indad, så lægemiddelstoffet omsluttes af en stump af membranen, som derpå afsnøres inde i cellen. Herefter skal lægemiddelstoffet frigives fra indposningen for at udøve en effekt i cellen, hvilket ofte kan være et begrænsende trin.
Den seneste model for, hvordan membranpenetrerende peptider fragter lægemiddelstoffer ind i celler, omfatter fire trin:
- Peptiderne kobles enten direkte til det biologisk aktive lægemiddelstof ved en kemisk kobling eller associeres ved binding mellem positive og negative ladninger.
- Derpå associerer peptiderne med cellemembranens negativt ladede overflade ved en elektrostatisk binding. Dette understøttes af, at optaget er størst, når peptiderne indeholder mange basiske aminosyrer, dvs. at peptidet er positivt ladet.
- Selve optaget sker ved en hurtig og energiuafhængig mekanisme, der ikke er relateret til tilstedeværelsen af en bestemt receptor. De nyeste resultater indikerer, at de fleste membranpenetrerende peptider - med eller uden et lægemiddelstof - optages via en form for endocytose. Men der er ikke tale om den klassiske form, som medieres via en binding til en receptor i cellemembranen. Dette forklarer til dels, hvorfor effekten af peptiderne ikke synes at være celletypespecifik.
- Til sidst frigives det aktive lægemiddelstof helt eller delvist fra indposningen samt fra de membranpenetrerende peptider, hvilket er afgørende for at opnå den ønskede farmakologiske effekt. Nogle typer peptider påvirker membranen i indposningen og sørger på den måde for fremkalde en frigivelse af lægemiddelstoffet i cellen.
Oprindelsen af TAT OG HCT
Tat er et protein fra HIV-1 virus. En del af det funktionelle domæne er isoleret og anvendes som det membranpenetrerende peptid Tat.
Calcitonin er ligeledes naturligt forekommende og bruges som lægemiddelstof i forbindelse med regulering af calciumstofskiftet ved Pagets knoglesygdom og osteoporose. hCT består af 75 procent af aminosyrerne i calcitonin.
Metoder og modeller
For at forklare mekanismen bag membranpenetrerende peptider og forstå deres effekt er det vigtigt, at man anvender relevante modeller. Vi brugte to forskellige cellemodeller og to forskellige peptider til forsøgene.
Det ene peptid er Tat, som også blev benyttet i det banebrydende studie fra 1999, og som er et af de mest lovende og bedst undersøgte membranpenetrerende peptider. Det andet peptid, vi har inkluderet i studierne, er hCT, som er en del af det større peptid calcitonin. De anvendte cellemodeller består begge af et tæt sammenhængende lag af celler, der har været dyrket i laboratoriet i to til tre uger. MDCK-cellerne kommer fra en nyre, mens Calu-3-cellerne har oprindelse i bronkierne. For at visualisere, hvor Tat og hCT lokaliseres i cellerne, er der koblet et grønt fluorescerende stof til peptiderne.
Tat ser ud til at optages mere effektivt i MDCK celler end hCT. Begge peptider lokaliseres i punkter i cellerne, og det tyder på et optag via endocytose, hvilket vi har verificeret ved andre typer af studier. Men i øjeblikket er det uvist, om peptidet også frigives fra indposningerne. Når man betragter lokaliseringen af peptiderne i Calu-3 cellerne, ser man, at hCT næsten ikke optages, men befinder sig mellem cellerne. Det gælder også i nogen grad for Tat, men her ses der dog noget optag. Ved at tage andre metoder i brug fandt vi, at grunden til de forskellige resultater er en højere koncentration af bestemte enzymer i Calu-3 cellerne end i MDCK cellerne. Vi fandt også, at Tat var mere stabilt overfor disse enzymer end hCT.
Stabiliteten og strukturen af peptiderne udenfor cellen såvel som i indposningerne inde i cellen har afgørende betydning for succes ved indgift af lægemiddelstoffer.
- Konfokalt horisontalt billede i to forskellige celletyper, MDCK og Calu-3, behandlet med to forskellige membranpenetrerende peptider, hCT og Tat. Den blå farve angiver cellekernerne og den grønne farve peptiderne. I MDCK celler lokaliseres begge peptider i afgrænsede punkter nær cellekernen. Billedet er anderledes i Calu-3 celler, hvor hCT primært lokaliseres mellem cellerne, mens Tat lokaliseres både i og udenfor cellerne. Den grønne farve udenfor cellerne kan være enzymatisk nedbrudt peptid. Arbejdet er udført i samarbejde med professor Hans Peter Merkle fra ETH Zürich og Dr. Rachel Tréhin fra ETH Zürich og Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School, USA.
Perspektiver
Opdagelsen af en række membranpenetrerende peptider har åbnet for nye muligheder i forbindelse med formulering af lægemidler. Der er dog stadig en række udfordringer, som skal undersøges nærmere. Bl.a. er det vigtigt at huske, at lægemiddelstoffet skal frigives for at virke i cellen; det er ikke nok at forøge optaget i cellen.
Derfor bør man supplere med modeller, hvor man måler en farmakologisk effekt og ikke blot konstaterer, om og hvordan membranpenetrerende peptider fragter et lægemiddelstof ind i cellerne. Hvis man ikke kan måle en effekt, er yderligere tiltag nødvendige, f.eks. at stabilisere peptidet, så det ikke mister virkningen efter optag, eller at udbygge peptidet med stoffer, der aktivt sørger for en frigivelse af lægemiddelstoffet i cellen.
På Institut for Farmaci undersøger vi i øjeblikket en række peptider for deres evne til at forøge frigivelse og dermed effekt af korte RNA sekvenser, siRNA, efter optagelse ved endocytose. Vi supplerer med mekanistiske studier for at forklare en eventuel positiv effekt.
Cellemodeller
MDCK cellerne (Madin-Darby canine kidney) stammer fra en hundenyre, og ved dyrkning danner de en forholdsvis simpel og velkarakteriseret cellemodel bestående af et enkelt, tæt lag af celler. Calu-3 cellerne stammer fra humane bronkier og udgør ved dyrkning en enkeltlaget cellemodel, med dannelse af mucus og en lang række enzymer, der er kendetegnende for epitel i luftvejene. Calu-3 cellemodellen repræsenterer derfor en model for en relevant administrationsvej.
