Metode til screening af modificerede proteinlægemidler under opbevaring
Førstegenerations-proteinlægemidler forsøges i dag modificeret bl.a. for at opnå en forlænget virkning, så patienten ikke skal tage sin medicin så ofte. Ved udvikling af de forbedrede lægemidler kan der spares tid og penge, hvis proteiners stabilitet under opbevaring kan relateres til let målbare parametre i laboratorieforsøg.
Af Charlotte Petersen, Lene Jørgensen, Susanne Hostrup, Jens Thostrup Bukrinsky og Sven Frøkjær
Før et stof kan anvendes som lægemiddel, skal det formuleres som fx en tablet, en salve eller injektionsvæske. Lægemidlet består således både af det virksomme lægemiddelstof og forskellige hjælpestoffer. Hjælpestoffernes funktion kan være at opløse lægemiddelstoffet, dække over en ubehagelig smag eller lugt, konservere eller stabilisere lægemiddelstoffet samt at gøre det teknisk muligt at fremstille lægemiddelformen.
I proteinlægemidler er det aktive lægemiddelstof et protein. Det er som regel nødvendigt at administrere proteinlægemidler som injektionsvæsker, fordi proteiner nedbrydes i mave-tarmkanalen.
Modificering af proteiner
Når et proteinlægemiddel injiceres, vil proteinet cirkulere i blodet en vis tid, som i nogle tilfælde kan forlænges ved at modificere proteinet. Fordelen er, at lægemidlet vil virke i længere tid, hvorfor patienten ikke skal tage sin medicin så hyppigt. Proteinets cirkulationstid i blodet kan fx øges via PEGylering eller acylering, hvor henholdsvis en polymer eller en fedtsyrekæde bindes til proteinet.
En tredje form for modifikation er glycosylering, som er en naturligt forekommende modifikation, hvor en sukkergruppe kobles til proteinet. Humane proteiner, der anvendes medicinsk, fremstilles normalt i cellekulturer med gensplejsede bakterieceller, gærceller eller pattedyrsceller, som har fået indsat det humane gen, der koder for proteinet. De sukkergrupper, som kobles på proteinet under produktionen, vil dog varierer fra værtscelle til værtscelle, og derfor kan sukkergrupperne på et protein i et lægemiddel være anderledes end sukkergrupperne på det naturligt forekommende protein i raske mennesker.
Det er imidlertid ønskeligt, at proteiner, der gives som lægemidler, minder mest muligt om de naturligt forekommende menneskelige proteiner, og derfor benytter den farmaceutiske industri i stigende omfang humane celler til fremstilling af medicinske proteiner. Det kan betyde, at sukkergrupperne på andengenerationslægemidler er forskelligt fra sukkergrupperne på førstegenerationslægemidler.
Proteinadsorption
Proteiner består af både hydrofile (vandelskende) og hydrofobe (vandskyende) aminosyrer, hvilket gør dem grænsefladeaktive. En grænseflade opstår, når en opløsning kommer i kontakt med et fast stof, en gas eller en væske, som ikke er blandbar med opløsningen.
De hydrofile dele af proteinet vil helst befinde sig i vand, mens de hydrofobe dele helst vil opholde sig ved grænsefladen for at undgå kontakt med vandet. Derfor søger proteiner i vandig opløsning normalt mod grænseflader, hvor de adsorberes og akkumuleres. Den primære drivkraft bag proteinadsorption til en hydrofob overflade er vekselvirkningen mellem proteinets hydrofobe aminosyrer og grænsefladen, men tiltrækningen mellem modsat rettede ladninger på proteinet og grænsefladen har også betydning.
Adsorption af proteiner i en lægemiddelbeholder vil føre til et fald i koncentrationen af det terapeutiske protein i beholderen – og dermed også i blodet efter administration. Det er uønsket, da det er vigtigt, at patienten får den tilsigtede mængde lægemiddelstof. Et andet problem i forbindelse med adsorption er, at proteiners rumlige struktur typisk ændres. Det skyldes, at proteinet ofte udfolder sig en smule ved grænsefladen for at øge kontaktfladen mellem de hydrofobe aminosyrer og den hydrofobe overflade. Hvis de adsorberede proteiner i lægmiddelbeholderen udbyttes med proteiner fra opløsningen, kan det resultere i, at der kommer proteiner med en ændret rumlig struktur ud opløsningen i beholderne. Det kan betyde, at de terapeutiske proteiner bliver biologisk inaktive.
Proteiner og proteinlægemidler
Proteiner er cellernes arbejdsheste og byggesten, og de er essentielle for alle levende organismer. Vore celler kan indeholde tusindvis af forskellige proteiner med mange forskellige funktioner. Nogle proteiner udgør de strukturelle dele af celler og væv, mens andre er hormoner eller fungerer som antistoffer eller som enzymer, der katalyserer en masse forskellige reaktioner.
Raske mennesker danner selv de proteiner, som kroppen har brug for, mens syge mennesker kan være ude af stand til det. Et eksempel er personer med type 1-diabetes, som ikke kan danne proteinet insulin. Insulin er med til at sørge for, at vores celler kan optage glukose, og insulin er derfor et meget vigtigt protein.
Proteiner er opbygget af 20 naturligt forekommende a-aminosyrer, som sættes sammen i en lang polymerkæde som perler på en snor. Der kan være flere tusinde aminosyrer i polymerkæden. I ethvert protein folder kæden sig sammen på en helt bestemt måde, hvilket giver proteinet en unik rumlig struktur, som er afgørende for, at det kan fungere korrekt.
Det er en stor udfordring at formulere proteinlægemidler, fordi proteiners tredimensionelle struktur er meget følsom overfor varme, rystelser, pH, hjælpestoffer og temperaturændringer.
Modificeringers effekt på proteinadsorption
- Fluorescensmåling med teknikken Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) er her anvendt til at bestemme adsorption af to varianter af et protein til en overflade. Figuren viser adsorption af proteinet med henholdsvis 0 og 5 sukkergrupper. Koncentrationen er ens for de to varianter. Desto højere fluorescensintensitet desto mere protein er adsorberet.
I laboratoriet undersøger vi effekten af acylering, PEGylering og glycosylering på adsorption af proteiner fra vandig opløsning til faste overflader. Målet er at udvikle en model, der kan bruges til at forudsige adsorption af proteiner fra vandig opløsning til faste overflader i fx beholdere.
PEGylering vil normalt gøre proteinet mere hydrofilt, og derfor forventes PEGylering at mindske adsorptionen til hydrofobe overflader. Omvendt øger acylering proteiners hydrofobicitet, og derfor forventes acylering at øge proteiners adsorption til hydrofobe overflader. Glycosylering gør ligesom PEGylering normalt proteinet mere hydrofilt, og derfor forventes glycosylering at mindske proteinadsorptionen til hydrofobe overflader.
Mængden af adsorberet protein på en overflade kan måles i laboratoriet ved hjælp af fluorescens – udsendelse af lys ved elektronovergange i molekyler. Vi anvender et specielt eksperimentielt set-up kaldet Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF), som kun belyser proteiner på overfladen.
Vi har undersøgt adsorptionen af et protein uden sukkergrupper og et protein med fem påsatte sukkergrupper. Indtil videre har resultaterne vist, at påsætningen af sukkergrupper ikke påvirker adsorptionen af det anvendte modelprotein.
De foreløbige resultater understøtter ikke vores teori. Der er dog så mange faktorer, som kan påvirke adsorptionen, at det er nødvendigt med yderligere forsøg for med sikkerhed at kunne udtale sig om, hvorvidt proteinadsorption vil kunne anvendes som en parameter for proteiners stabilitet under opbevaring.
- TIRF apparatet på Institut for Farmaci og Analytisk Kemi bestemmer proteiners adsorption til overflader ved hjælp af fluorescens. Til højre: Nærbillede af TIRF cellen i prøvekammeret.
Acylering, pegylering og glycosylering
Ved acylering bindes en fedtsyrekæde til proteinet. Formålet er typisk at opnå en længere virkningstid. Acyleringen øger proteinets affinitet til serum albumin i blodet, og det medfører, at proteinets cirkulationstid i blodbanen øges. I nogle tilfælde inducerer acylering også selvassociering, hvor proteinet danner komplekser med sig selv, hvilket vil forøge virkningstiden yderligere.
Eksempelvis øger fedtsyrekæden C14 (CH3(CH2)nCOOH) insulins cirkulationstid i blodbanen.
Ved PEGylering bindes en polymer af polyethylenglycol (PEG) til proteinet. Det PEGylerede protein udskilles langsommere gennem nyrerne, fordi molekylet er større, og desuden beskytter polymeren proteinet mod nedbrydning i kroppen.
Strukturformel for polymeren af polyethylenglycol, der kobles til proteiner for at øge proteiners cirkulationstid i blodet. Eksempelvis øger PEGylering Interferon-αs cirkuleringstid i blodbanen.
Ved glycosylering kobles sukkermolekyler til proteinet. Glycosyleringsmønsteret afhænger af, hvilken type organisme proteinet fremstilles i.
EPO er et eksempel på et proteinlægemiddel, der først blev produceret med sukkergrupper, som er forskellige fra de humane, men som nu produceres som humant EPO.
