Ny SAXS’et metode på DFU
Proteiner er naturens nanomaskiner, som udfører livsnødvendige funktioner, og når de ikke virker korrekt, er resultatet sygdom. Proteiner fungerer ved at ændre facon og indgå i komplekser. SAXS er en velegnet metode til at studere proteiner i aktion.
Af Bente Vestergaard, Mads Gravers Jeppesen, Ole Kristensen, Katrine Nørgaard Toft, Jette Sandholm Kastrup og Michael Gajhede
Fra Lægemiddelforskning 2006
En levende celle er en fantastisk travl enhed, hvor et stort antal funktioner konstant skal opretholdes – fx omsætning af energi, nedbrydning af affaldsstoffer, vekselvirkninger med andre celler, reaktion på signaler og tilpasning til omverdenen. Langt de fleste af disse funktioner varetages af proteiner. Det er karakteristisk for proteiner, at de specifikt kan interagere med biologiske makromolekyler, fx andre proteiner eller DNA, og med små organiske molekyler som neurotransmittere eller lægemiddelstoffer.
Når proteinerne ikke opretholder de vitale funktioner, bliver cellen og i nogle tilfælde hele organismen syg. Derfor er det vigtigt at undersøge, hvordan proteinerne fungerer, for at forstå det molekylære grundlag for mange forskellige sygdomme.
SAXS i strukturel biologi
En strukturbiolog udfører eksperimenter, der kan vise den tredimensionelle struktur af biologiske makromolekyler som proteiner eller DNA. Når man kender et proteins struktur, kan man bruge denne information til at prøve at forstå, hvordan proteinet fungerer i cellen. Strukturelle undersøgelser af proteiner, der kan forandre sig under forskellige betingelser, er en særlig udfordring, men giver også ekstra informationer om proteinernes funktion.
Vi bruger metoden SAXS (Small-Angle X-ray Scattering), som oversat til dansk betyder ”røntgenbaseret småvinkelspredning”. En fokuseret røntgenstråle sendes gennem proteinopløsningen, og dernæst målerman på den spredning af røntgenstrålen, som proteinopløsningen giver anledning til. Ud fra den målte spredning kan man beregne, hvordan proteinet eller proteinerne så ud.
Metoden har den store fordel, at molekylerne – fx proteiner – kan undersøges i opløsninger, der minder om fysiologiske betingelser. Det er muligt at undersøge molekyler under mange forskellige betingelser og endda blandinger af flere molekyler samtidig.
Proteiner skifter facon
Proteiner er dynamiske molekyler, som ændrer deres tredimensionelle facon, når de vekselvirker med andre molekyler, eller når forholdene inde i cellen ændres. Det er netop gennem dette tredimensionelle samspil med hinanden og omverdenen, at funktionerne bliver til.
Signaler sendes og opfanges i cellen via kontakt mellem molekyler, dannelse af store komplekser af molekyler og tredimensionelle forandringer i proteinernes struktur. Der er tale om et gigantisk og kompliceret netværk af signaler mellem cellens tusinder af biologiske molekyler, der som perfekt designede nanomaskiner udfører deres funktioner igen og igen og holder cellen i live.
Struktur og funktion er altså tæt forbundet i biologien. Derfor er studier af, hvordan proteiner ændrer deres facon, eller hvordan de interagerer med hinanden, meget væsentlige for såvel lægemiddelforskning som grundvidenskabelige studier.
I gruppen for Biostrukturel Forskning benytter vi en metode, der kaldes SAXS, til studier af proteiners dynamik. En stor fordel ved metoden er, at man kan undersøge proteinerne ved fysiologisk relevante betingelser. Vi opnår hermed information om proteiners tredimensionelle faconer i deres naturlige miljø. Hvis flere proteiner danner komplekser, er det også muligt at se dette. Man kan også se, hvis et område af proteinet er fleksibelt og bevæger sig rundt i opløsningen.
- Proteinet Release Factor (RF) vekselvirker med cellens proteinfabrik, ribosomet, og afslutter proteinsyntesen. Under reaktionen ændrer RF facon. Der er brugt tre forskellige metoder til at undersøge RF, hvilket har været vigtigt for at forstå proteinets funktion: Elektronmikroskopi (A), røntgenkrystallografi (B) og (C) og SAXS (D). RF er farvet rød på samtlige fi gurer. A: RF på ribosomet, hvor det sørger for frigivelse af nydannede proteiner. Ribosomets lille underenhed er lysegrå, mens den store underenhed er mørkegrå. RF er vist i forstørrelse, så man tydeligere ser proteinets aktive facon på ribosomet. B: Krystalstruktur af RF. Her er proteinet lukket sammen, og denne facon bruges, når RF interagerer med et andet protein, der aktiverer RF. C: RF er her vist sammen med dette protein, som er farvet gult. D: RF’s struktur i opløsning. Det ene domæne på proteinet svinger frit, hvilket er vist i 5 forskellige orienteringer med forskellige farver.
Proteinsyntesens afslutning
Det første projekt i gruppen fokuserede på et protein fra bakterier, som kaldes release factor (RF). Proteinets funktion er at binde til cellens proteinfabrikker, ribosomerne, hvor det afslutter syntesen af nye proteiner og frigiver de nydannede proteiner til cellen, så cellen kan benytte dem. Proteinsyntesen er helt central for cellernes overlevelse – ingen nye proteiner betyder cellens død. Man vil derfor gerne forstå forskellene på bakteriers og menneskers proteinsyntese, så man kan udvikle nye antibiotika, der meget specifikt blokerer bakteriernes proteinsyntese. Vi vil gerne forstå, hvordan RF kan aflæse på ribosomet, at proteinsyntesen er slut, og derfor undersøgte vi, hvordan proteinet ændrede facon, når det var i opløsning, på ribosomet eller i kompleks med andre proteiner.
Dannelse af fibriller
Et andet spændende projekt omhandler fibrillering af insulinmolekyler. Insulin kan ligesom mange andre proteiner og peptider danne nogle gigantiske netværk, hvor tusinder og atter tusinder af proteinenheder bindes sammen til stor skade for organismen. Disse netværk kaldes amyloide fibriller. Fibriller er forbundet med meget alvorlige sygdomme som Alzheimers sygdom, Huntingtons sygdom og Creutsfeldt Jacobs syndrom. Desuden skaber proteinfibrillering store problemer i forbindelse med fremstilling og opbevaring af proteinbaserede lægemidler som insulin.
Ved hjælp af SAXS-analyser af hele tidsforløbet fra tilstedeværelse af individuelle insulinmolekyler til dannelsen af kæmpemæssige insulinfibriller, har vi opnået en større forståelse af processen. Det langsigtede mål er at bidrage med viden, der i sidste ende kan føre til udvikling af nye lægemidler til forebyggelse eller behandling af sådanne alvorlige sygdomme.
Dynamiske proteinkomplekser
Et fokusområde for Biostrukturel Forskning er, hvordan visse proteiner – såkaldte adaptorproteiner – danner meget dynamiske komplekser, når signaler sendes ind i cellen. Signalering indenfor cellen er helt central for, hvordan en celle opfører sig, når den er syg. Hvis cellen fx ikke reagerer fornuftigt på signalet om, at den bør dø, opstår der cancer, hvor syge celler deler sig hurtigt frem for at gå til grunde. Det er vores tanke at anvende SAXS metoden til at studere disse komplekser. Og vi har en vision! I et tværfagligt samarbejde udvikler vi en ny metode: En chip, hvor proteinerne bevæger sig i nanokanaler, vil kunne benyttes til at fange de enkelte trin af molekylernes forandringer og interaktioner. Man kan altså gendanne hvert enkelt billede af, hvordan komplekserne ændrer sig. Vi opnår herved enkeltbilleder af en lynhurtig proces i cellen, der løber over mikrosekunder eller hurtigere. Enkeltbillederne kan sættes sammen til en film, der kan afspilles langsomt, så vi kan følge processens udvikling. Vi er sikre på, at premiereaftenen bliver noget ganske særligt!
BIO-X-TAS-gruppens arbejde
I et tværfagligt forskningsprojekt arbejder vi sammen med DTU, KVL og Novo Nordisk A/S i projektgruppen BIO-X-TAS omkring udviklingen af en chip – en såkaldt μTAS (micro Total Analysis Systems). Det overordnede mål er at reducere prøveforbruget samt at automatisere processerne, så rigtig mange SAXS-analyser kan foretages på kort tid. Man bruger derfor betegnelsen lab-on-a-chip; et helt laboratorium og medarbejdere på en lille chip. Projektets mål er at kunne foretage automatiserede analyser af proteinopløsninger bestående af få hundrede nanoliter. En nanoliter er en milliontedel af en milliliter, så det er meget små mængder, vi her taler om. En sådan chip kan bruges til mange spændende formål. Fx vil den være ideel til at undersøge, hvad der kan få proteinerne til at ændre deres struktur. Man kan også undersøge, hvordan man holder proteinbaserede lægemiddelstoffer i opløsning, samt hvilken indflydelse tilsætningsstoffer har på selve lægemiddelstoffet.
En enorm opbakning
Gruppens fokus på SAXS metoden er blevet mødt med stor interesse og har skabt mange værdifulde samarbejdsrelationer. Det drejer sig om samarbejder internt på DFU med Gruppen for Lægemiddelformulering og Biomakromolekyler, samt eksternt med Danmarks Tekniske Universitet, Den Kgl. Veterinær- og Landbohøjskole, Aarhus Universitet, Novo Nordisk og EMBL i Hamburg. Inden for de sidste to år er det også lykkedes at opnå store bevillinger, som muliggør en aktiv og målrettet indsats. Ikke mindst har vi sammen med samarbejdspartnerne fra KVL, DTU og Novo Nordisk A/S fået fondsmidler fra NABIIT, der er statens tværfaglige satsning indenfor nanovidenskab og -teknologi, bioteknologi og IT, og SAXS-initiativet er også støttet af Novo Nordisk A/S, Nano- og Microelektronik Centret ved DTU, og Statens Forskningsråd for Sundhed og Sygdom, FSS.
Vi har allerede sammen opnået betydningsfulde resultater, og flere er på vej i nærmeste fremtid.
