Ny viden om selens omdannelse i kroppen
Selen er et livsnødvendigt grundstof. Men vi ved ikke ret meget om, hvordan selen omdannes og udskilles fra kroppen. Det kan undersøges ved at påvise de selenforbindelser, der optræder i urin. Det er lykkedes os at identificere den mest fremtrædende selenforbindelse i human urin.
Af Bente Gammelgaard, Lars Bendahl, Ole Jøns, Kim Grimstrup Madsen og Jesper Bjerrum.
Fra Lægemiddelforskning 2002
Selen er et livsnødvendigt grundstof, som indbygget i proteiner fungerer som antioxidant i kroppen. Kliniske undersøgelser har desuden vist, at selen har en beskyttende virkning mod visse former for kræft.
Det er kendt, hvordan selen indbygges i kroppens proteiner, men man ved ikke ret meget om, hvordan selen omdannes og udskilles fra kroppen. Man har en formodning om, at den kræftforebyggende effekt ikke skyldes de selenholdige proteiner, men andre selenholdige forbindelser.
Derfor er det vigtigt at forstå, hvilke forbindelser indtaget selen omdannes til i kroppen, således at eventuelle kræftforebyggende selenforbindelser kan identificeres.
Derfor undersøger vi selens omdannelse og udskillelse ved at identificere de selenforbindelser, der optræder i urin. Det er lykkedes os at identificere den mest fremtrædende og hidtil ukendte selenforbindelse i human urin.
Den kemiske detektivs værkstøjskasse
Spektrofotometri - UV-absorbans:
Mange stoffer absorberer lys. UV-absorbans er et mål for koncentrationen af de tilstedeværende stoffer, der absorberer ved den givne bølgelængde. Metoden er uspecifik, fordi mange stoffer absorberer ved samme bølgelængde, og der opnås ikke information om forbindelsens struktur. Nogle stoffer absorberer slet ikke.
Massespektrometri:
Stofferne i en prøve detekteres efter deres masse-ladningsforhold, hvilket giver oplysning om molekylets vægt. Prøven skal ioniseres for at nå ind i massespektrometret. Det kan gøres på forskellige måder:
ESI-MS:
ElectroSpray Ionization Mass Spectrometry: Prøven ioniseres ved atmosfærisk tryk ved at pumpe opløsningen gennem et stålrør, som er pålagt højspænding. Herved opnås en fin spray af elektrisk ladede dråber. Ved efterfølgende opvarmning overføres ladningen til det enkelte molekyle. Molekylerne slås ikke i stykker og der kan således opnås information om molekylets masse. Teknikken er særlig velegnet til molekyler, som relativt nemt lader sig ionisere.
APCI-MS:
Atmospheric Pressure Chemical Ionization: Efter indføring og opvarmning af prøven ioniseres molekylerne ved at passere en elektrode, der udsender en elektrisk udladning. Metoden kan ionisere de fleste forbindelser, men der er dog en risiko for, at de oprindelige molekyler slås i stykker.
Tandem-MS:
I denne teknik opsamles molekyler med det masse-ladningsforhold, man ønsker at analysere, d.v.s. den "ukendte" forbindelse. Herefter slås de enkelte molekyler i stykker ved at bombardere dem med en gas. Ved at studere, hvordan molekylet fragmenterer, kan man få oplysninger om, hvilke kemiske grupper molekylet indeholder.
ICP-MS:
Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry: Teknikken har en følsomhed, som for selen er 100-1000 gange større end de øvrige MS-teknikker.
Prøven forstøves ind i et ca. 8000ºC varmt plasma af argon. Herved atomiseres og ioniseres prøven, hvorefter ioner af alle de tilstedeværende grundstoffer indføres i massespektrometret.
Denne teknik adskiller sig fra de øvrige MS-teknikker ved ikke at give oplysninger om strukturen af den oprindelige forbindelse. Ved kobling af ICP-MS til kromatografi detekteres kun de forbindelser, der indeholder det grundstof, man leder efter. Der er således ikke støj fra alle de andre tilstedeværende forbindelser.
Koblede analyseteknikker
I den danske befolkning er koncentrationen af selen i urin i størrelsesordenen 30 nanogram pr. milliliter. Det er en forholdsvis lav koncentration sammenlignet med mange andre lande, hvilket skyldes, at dansk jord ikke er særlig selenholdig. Størstedelen af den selen, vi indtager, kommer nemlig fra planter, som optager selen fra jorden.
Den totale selenmængde, der findes i urin, er fordelt mellem flere forskellige selenholdige forbindelser, hvilket kan observeres ved at analysere urinprøver ved kromatografi, som separerer de forskellige forbindelser.
Da koncentrationen af de enkelte forbindelser er uhyre lav, er det nødvendigt med en meget følsom metode til at måle mængden af hver enkelt forbindelse. Her benytter vi ICP-massespektrometri.
Samtidig findes der utallige andre stoffer i urin i koncentrationer, der kan være flere størrelsesordener højere. Før selenforbindelserne kan identificeres ved massespektrometri, skal de således først adskilles fra alle de andre stoffer, der er tilstede i urin og samtidig opkoncentreres.
Det er en vanskelig opgave, fordi selenforbindelserne er små molekyler, som ligner de andre tilstedeværende stoffer kemisk. Opgaven kan kun løses ved at anvende en kombination af flere forskellige kromatografiske principper og koble separationsmetoderne til følsomme og selektive detektionsmetoder.
- Skematisk oversigt over oprensningen af urinprøver. Urinprøver med højt indhold af selen udvælges og samles i en pool. Første oprensning sker på en række små kolonner. Udtrækkene samles, inddampes og påsættes en præparativ kolonne. De selenholdige fraktioner opsamles, inddampes og påsættes yderligere en kromatografisk kolonne. De opsamlede fraktioner inddampes og analyseres ved massespektrometri.
På kromatogrammerne ses det, at UV-signalet falder og adskilles fra selensignalet under oprensningen.
Kromatografi
Vi anvendte urin fra frivillige personer, der havde indtaget et gærpræparat, som er beriget med selen, og som sælges som kosttilskud på bl.a. apoteket. Efter indtagelse af præparatet i en uge leverede forsøgspersonerne urinprøver, som blev opsamlet over hele dagen.
Prøverne blev analyseret, og prøver med højt indhold af selen blev samlet i en urin-pool. Fra tidligere undersøgelser ved vi, at der dannes mest af én bestemt selenforbindelse ved indtagelse af selen, men forbindelsens kemiske sammensætning var ukendt.
Der blev anvendt tre forskellige kromatografiske principper til oprensningen, som blev fulgt ved at analysere prøven undervejs. Analyserne viste, at mængderne af alle andre stoffer falder under oprensningen, mens selensignalet til gengæld stiger. Selenforbindelsen i den oprensede prøve blev herefter identificeret ved massespektrometri.
Massespektrometri
Ved massespektrometri detekteres elektrisk ladede ioner efter deres masse-ladningsforhold. Den oprensede selenforbindelse var imidlertid vanskelig at ionisere, og derfor var det ikke muligt at bruge den mest anvendte teknik, ESI-massespektrometri.
Heldigvis råder instituttet over flere massespektrometre med forskellige ioniseringsmetoder. Det lykkedes at ionisere prøven med APCI-massespektrometri.
Analysen viste fingeraftrykket af den ukendte selenforbindelse. Selen forekommer naturligt som seks forskellige isotoper i et bestemt masseforhold, hvor 80Se udgør ca. halvdelen. Et massespektrum af en selenholdig forbindelse vil således altid vise det karakteristiske mønster, som er bestemt af forholdet mellem isotoperne.
Næste trin var tandem-massespektrometri, hvor molekylet slås i stykker. Analysen viser, hvilke kemiske grupper, der findes i det selenholdige molekyle. Den isolerede forbindelse består af en methyl-selen-gruppe på et sukkermolekyle. Vi er i øjeblikket i færd med at fastlægge identiteten af sukkerdelen.
Der er ikke tidligere påvist en sådan selenforbindelse i human urin, og den er meget forskellig fra de forbindelser, som man tidligere har foreslået kunne optræde i urin. Identifikationen af denne forbindelse kan således medføre, at man må revurdere hvorledes selen omsættes i kroppen.
