Øget forståelse af vigtig receptor i hjernen

Signalstoffet glutaminsyre spiller en central rolle for nervedøden i flere neurodegenerative sygdomme, og derfor er der stor farmaceutisk interesse i nervecellernes receptorer for stoffet. Vi har kortlagt, hvordan glutaminsyre binder sig til en receptor og har kastet lys over, hvordan receptoren fungerer.

En receptor er et protein i cellemembranen, som oversætter et ydre signal til forandringer i cellens biokemiske processer. Hjernens nerveceller rummer adskillige receptorer, som aktiveres af forskellige signalstoffer, som formidler nervecellernes indbyrdes kommunikation. Når et signalstof bindes til receptoren, videresender receptoren signalet til cellens indre.

Et af de mest udbredte signalstoffer i hjernen og centralnervesystemet er det stimulerende signalstof glutaminsyre. Glutaminsyre udøver sin effekt via to typer af receptorer; de ionotrope og de metabotrope receptorer. De metabotrope receptorer tilhører en stor familie af receptorer, der alle formidler deres effekt gennem de såkaldte G-proteiner, som udgør omstillingsbordet til cellens interne biokemiske maskineri.

Der har længe været stor interesse for de metabotrope glutaminsyre-receptorer, da de er interessante mål i behandlingen af en række neurologiske og psykiatriske lidelser. De mest anerkendte terapeutiske mål for stoffer, der virker på disse receptorer, er behandlingen af sygdomme som epilepsi, iskæmi og flere neurodegenerative lidelser, hvoriblandt Alzheimers sygdom er den mest kendte. Samtidig tyder adskillige undersøgelser på, at lidelser som angst, skizofreni og visse former for smerte med succes vil kunne behandles med stoffer, som målrettes mod de metabotrope receptorer for glutaminsyre.

Man har klonet otte forskellige metabotrope receptorer for glutaminsyre, kaldet mGluR1-8. Stimulation af hver af disse otte receptorer medfører forskellige påvirkninger af de interne processer i cellen. Derfor er egenskaberne af de stoffer, der binder til den enkelte receptor vigtige set fra en terapeutisk synsvinkel.

I flere neurodegenerative og psykiske sygdomme er koncentrationen af glutaminsyre forhøjet i hjernen, hvilket fører til overstimulering af nervecellerne, som beskadiges eller dør. Når glutaminsyre binder sig til mGluR1 og mGluR5 øges cellens aktvitetsniveau, og derfor er man interesseret i stoffer, der hæmmer eller blokerer signalet gennem disse receptorer. Når glutaminsyre binder sig til de resterende seks receptorer, dæmpes cellens aktivitetsniveau. Derfor ønsker man her lægemiddelstoffer, der stimulerer disse receptorer.

Som alle andre G-protein-koblede receptorer besidder de metabotrope receptorer for glutaminsyre en kæde, som gennemskærer cellemembranen syv gange. Derimod adskiller mGlu-receptorerne sig markant fra de øvrige receptorer ved at have en usædvanligt stor del af receptoren på ydersiden af membranen.

For godt syv år siden opdagede forskere hos Novo Nordisk og firmaets datterselskab ZymoGenetics, at aminosyresekvensen af den ydre del af receptoren minder om en familie af proteiner, som findes i bakterier. Denne opdagelse skulle hurtigt vise sig at blive en milepæl i udforskningen af de metabotrope receptorer for glutaminsyre. Strukturen af et af disse bakterieproteiner var nemlig tidligere blevet bestemt ved hjælp af røntgenkrystallografi, og på baggrund af denne krystalstruktur konstruerede ZymoGenetics og Novo Nordisk en computermodel af den ydre del af mGluR1. I følge modellen består den ydre del af receptoren af to domæner, der sammen danner en kløft.

Det er kendt fra bakterieproteinet, at forskellige aminosyrer bindes nede i kløften til det ene af disse to domæner. Glutaminsyre er ligeledes en aminosyre, og man går ud fra, at den ydre del af mGluR1 eksisterer i to former; en åben, inaktiveret form og en lukket, aktiveret form, hvortil glutaminsyre er bundet efter samme princip som i bakterieproteinet.

Computermodeller er kun til nytte i forskning, hvis de til en rimelig grad afspejler virkeligheden. Derfor er det vigtigt at udfordre modellerne. Det gjorde ZymoGenetics og Novo Nordisk-forskerne selv i 1993 ved at demonstrere, at to specifikke aminosyrer i receptoren binder grunddelen af glutaminsyre. Det blev gjort ved at udskifte de to bindende aminosyrer i mGluR1 med andre aminosyrer.

Mutationerne af de to bindende aminosyrer, Serin165 og Threonin188, reducerede på dramatisk vis glutaminsyres evne til at binde sig til receptoren og aktivere den. Dette var den første stærke indikation af, at homologien mellem bakterieproteinet og mGluR1 ikke var tilfældig, og at den konstruerede computermodel ville blive til stor gavn for forståelsen af receptorens aktiveringsmekanismer.

Man vidste altså nu, at grunddelen af glutaminsyre bindes til to specifikke aminosyrer i kløften på receptorens ydre del. Vort næste mål var at finde ud af, hvor den sidste funktionelle gruppe i glutaminsyre, en carboxylsyregruppe, bindes i mGluR1.

Her kunne vi ikke bruge bakterieproteinet som udgangspunkt, da de tre aminosyrer, der binder til bakterieproteinet ikke har denne carboxylsyregruppe. Imidlertid viste modellen, at en bestemt aminosyre i glutaminsyre-receptoren, Arginin78, lå i en afstand fra Serin165 og Threonin188, der muliggjorde, at glutaminsyre kunne binde sig til alle tre. Glutaminsyrens negativt ladede carboxylsyregruppe ville kunne danne en saltbro til den funktionelle gruppe af Arginin78, der er positivt ladet.

For at teste hypotesen muterede vi Arginin78 til en anden aminosyre, leucin, og konstaterede, at dette markant svækkede glutaminsyres evne til at aktivere receptoren. I en anden mutant blev Arginin78 muteret til en glutaminsyre, og det resulterede i, at receptoren blev helt ude af stand til at blive aktiveret af signalstoffet. Dette kan forklares med, at de to negativt ladede carboxylsyregrupper, der møder hinanden i bindingen i denne mutant, frastøder hinanden.

Konklusionen er, at Arginin78 i mGluR1 udgør den tredie part i bindingen af glutaminsyre, som forudsagt af computermodellen.

Hvis teorien om, at den ydre del af mGlu receptorerne findes i en åben, inaktiveret form og en lukket, aktiveret form holder stik, kan man forestille sig, at signalet gennem receptoren kan hæmmes ved at blokere for sammentrækningen af receptorens ydre del. For at undersøge om dette princip kunne udnyttes i medicinalkemisk sammenhæng benyttede vi os af, at metalionen zink (Zn²⁺) kan bindes til aminosyrerne histidin, cystein, asparaginsyre og glutaminsyre. Via introduktion af disse aminosyrer i bestemte positioner i forhold til hinanden i receptoren skabes der bindingssteder for zink.

Vi valgte at konstruere et bindingssted for zink i toppen af det domæne i den ydre del af mGluR1, som ikke binder glutaminsyre. Forsøgene viste, at bindingen af zink til den modsatte side af bindingsstedet for glutaminsyre hæmmer signalet gennem receptoren. Vores hypotese er, at zinkbindingen trækker strenge i dette område af receptorens ydre del sammen og derved forhindrer den sammentrækning af hele den ydre del, som er nødvendig for at glutaminsyre kan aktivere receptoren. Dette princip vil være brugbart i design af lægemiddelstoffer, som kan blokere mGluR1. Som tidligere nævnt er sådanne stoffer af stor interesse fra en terapeutisk synsvinkel.

Som det vil være fremgået, har den konstruerede computermodel af mGluR1's ydre del vist sig at være meget repræsentativ for virkeligheden, og modeller af de ydre dele af andre metabotrope receptorer er nu blevet udarbejdet ud fra samme princip. Flere forskergrupper arbejder nu intenst på at opnå en krystalstruktur af den ydre del af mGluR1 og andre af de metabotrobe receptorer for glutaminsyre. En sådan struktur vil udgøre den næste milepæl i forskningen.