Proteinlægemidler med en beskyttende kappe
En tredjedel af alle nye lægemidler i kliniske forsøg er baseret på proteiner. De terapeutiske perspektiver er store, men desværre er proteiner ustabile og har dårlig holdbarhed. Problemerne kan afhjælpes ved at indsvøbe proteinet i en kappe af polymerer.
Af Pernille Stigsnæs, Eva Horn Møller, Simon Bjerregaard, Marco van de Weert og Sven Frøkjær.
Fra Lægemiddelforskning 2005
I proteinlægemidler er det aktive stof et stort biomolekyle - et protein. I dag findes der ikke ret mange proteinlægemidler på hylderne i de danske apoteker, men det vil ændre sig dramatisk inden for en kort årrække.
Lægemidler baseret på proteiner er i rivende udvikling, og omkring en tredjedel af alle nye lægemidler i kliniske forsøg er proteiner eller peptider. Anvendelsesområderne er mange forskellige former for alvorlige og kroniske sygdomme som kræft, diabetes og leverbetændelse.
En stor fordel ved proteiner er, at de kan have en meget selektiv virkning i organismen i stil med kroppens egne hormoner eller enzymer. Men i praksis er det svært at lave lægemidler med proteiner, fordi proteiner ofte er ustabile og har dårlig holdbarhed.
Et protein består af en lang kæde af aminosyrer, som folder sig sammen til en specifik tredimensionel struktur, og både aminosyresekvensen og foldningen skal være korrekt for at opnå den optimale virkning i kroppen. Hvis proteinet folder forkert, er der ikke kun risiko for at det bliver uvirksomt; immunsystemet kan også reagere overfor lægemidlet, hvilket kan medføre alvorlige bivirkninger for patienterne.
Hvis foldningen af proteinet forstyrres eller ødelægges, kan proteinerne i et lægemiddel klumpe sig sammen og danne fibriller. Dette kan fx ske ved produktionen af lægemidlet eller under opbevaring. Fibrildannelse er en irreversibel proces, og fibriller er højst uønskelige, fordi proteinet inaktiveres. Fibrildannelse af kroppens egne proteiner er i øvrigt relateret til uhelbredelige sygdomme som Alzheimers syge, Parkinsons syge og Creutzfeldt-Jakobs syge, den menneskelige parallel til kogalskab.
Proteiners lave stabilitet betyder også, at proteinlægemidler generelt har en dårlig holdbarhed ved opbevaring. Et vigtigt mål er derfor at udvikle mere stabile præparater. Man vil helst fremstille lægemidler, som allerede er opløst og klar til injektion, men for at bevare proteinets virksomme struktur kan det være nødvendigt at formulere lægemidlet som et frysetørret pulver, der opløses lige før brug.
- Hvis proteinerne klumper sig sammen i fibriller, fx under opbevaring, kan proteinlægemidlet miste sin effekt. Fibrillering måles ved at tilsætte Thioflavin T til en opløsning med proteinet; stoffet udsender en karakteristisk fluorescens, når der dannes fibriller. Den røde kurve viser test af glukagon, mens den blå kurve viser test af PEGyleret glukagon. Målingen er foretaget ved 1 mg/ml protein og pH 2.5. Glukagon fibrillerer efter 25 timers rystning, hvorimod PEGyleret glukagon ikke fibrillerede under forsøget.
Polymerer stabiliserer
På grund af de store terapeutiske perspektiver forskes der meget i at optimere proteinlægemidlers egenskaber. En lovende teknik er PEGylering, som har vundet stor udbredelse. Her kobles den ugiftige polymer polyethylen glycol (PEG) direkte på proteinerne ved hjælp af kovalente kemiske bindinger. Polymerer er lange kæder, som formentlig omslynger proteinerne og danner en beskyttende kappe. PEGyleringen ændrer proteinets egenskaber, og derved kan der opnås fordele som længere virkningstid i kroppen og bedre holdbarhed. Ved at variere størrelsen af polymeren samt påhæftningsstedet på proteinet, kan virkningen og stabiliteten af det PEGylerede protein ændres og optimeres efter ønske.
Fordelene er dog ikke altid gratis, for proteinet kan blive så grundigt pakket ind, at der opstår risiko for, at PEGyleringen ændrer eller helt slukker for proteinets biologiske aktivitet. Derfor skal reaktionen mellem protein og polymer styres med omhu. Anvendelse af en større polymer eller påhæftning af flere polymerer vil typisk medføre bedre holdbarhed og forlænget cirkulationstid i kroppen, men øger også risikoen for tab af farmakologisk virkning. Derfor er det nødvendigt at optimere PEGyleringen for hver enkelt sammensætning af polymer og protein.
PEGylering af glukagon
- PEGyleret glukagon, hvor polymerkæden danner en kappe rundt omkring proteinet. Glukagon anvendes til akut behandling af insulinchok hos diabetespatienter.
Vi har opnået gode resultater med PEGylering af proteinlægemidlet glukagon, der anvendes til akut behandling af insulinchok, som kan ramme diabetespatienter, når deres blodsukker er for lavt. På grund af begrænset holdbarhed fremstilles glukagon som et pulver, som skal opløses før injektion. Den lave stabilitet af glukagon medfører, at proteinet let klumper sig sammen i fibriller, hvilket fører til dannelse af en gelagtig struktur.
For at undersøge den fysiske stabilitet har vi udsat glukagon og PEGyleret glukagon for farmaceutiske processer såsom frysetørring. Frysetørring kan medføre ændringer af glukagons rumlige struktur og fibrillering. Fibrillering kan måles ved at tilsætte et fluorescerende stof, Thioflavin T, til en proteinopløsning. Stoffet udsender en karakteristisk fluorescens ved tilstedeværelse af fibriller. Ved testen rystes proteinopløsningerne, og der måles fluorescens som udtryk for dannelse af fibriller over tid.
I forsøgene var PEGyleret glukagon langt mere stabilt end det nøgne protein. Normalt danner glukagon fibriller efter ca. 1 døgn, hvor der ses en drastisk stigning i fluorescenssignalet. Men PEGyleret glukagon fibrillerer ikke, selv efter 4-5 døgn.
Resultaterne viser, at stabiliteten af glukagon kan forbedres ved PEGylering, og det åbner en potentiel mulighed for, at PEGylering kan benyttes til udvikling af et flydende glukagonpræparat i stedet for det nuværende frysetørrede. Et flydende præparat vil lette patienters anvendelse af glukagon. Videre studier vil vise, om det er muligt at designe PEGyleret glukagon på en måde, så den biologiske aktivitet bibeholdes.
Mange fordele ved PEGylering
PEGylering giver åbenbare fordele, men rejser også forskningsmæssige udfordringer:
- Længere virkningstid: Proteinet beskyttes mod fysisk og kemisk nedbrydning i kroppen, og desuden udskilles det PEGylerede protein langsommere gennem nyrerne, fordi molekylet er større. Med en længere virkningstid kan det proteinbaserede lægemiddel indgives med større mellemrum. Der findes allerede enkelte lægemidler på markedet, som indeholder PEGylerede proteiner. Et eksempel er PegIntron® mod leverbetændelse. PegIntron® skal kun injiceres én gang om ugen, hvor man tidligere var nødt til at injicere tilsvarende midler tre gange om ugen.
- Svagere effekt: Polymeren lægger sig om proteinet som en beskyttende kappe, og derfor vil effekten i kroppen være lavere. Det skyldes, at proteinet også skærmes mod selve virkningsstedet på cellerne. Dette kan både reducere effekten og formindske risikoen for bivirkninger. Kunsten er at finde den rette balance.
- Lavere immunologisk respons: Selv om humane proteiner kan produceres med rekombinant DNA-teknologi, kan der være små strukturelle forskelle mellem proteiner, som er dannet i kroppen, og proteinlægemidler, som produceres i bioreaktorer. Strukturforskelle kan føre til, at immunforsvaret går til angreb på proteinet, specielt ved længere tids gentagen brug. Ved PEGylering kan proteinlægemidlet beskyttes mod genkendelse af immunsystemet. Derved kan immunologiske bivirkninger formindskes eller undgås.
- Bedre holdbarhed: Proteinlægemidler kræver ofte særlig opbevaring, fx i køleskab, eller alternativt skal lægemidlerne opløses i væske lige inden brugen på grund af proteinernes lave holdbarhed. Ved PEGylering beskyttes proteinerne bl.a. mod fibrillering og dermed nedsættes risikoen for inaktivering af lægemidlet.
