Screening af lægemiddelstoffers evne til at passere tarmvæggen
Transportegenskaberne for lægemiddelstoffer screenes i en model for tarmvæggen. Men en stor del af stofferne har svært ved at blive opløst i modellens transportmedie. derfor er der udviklet simulerede tarmvæsker, som efterligner de naturlige processer i tyndtarmen.
Af Marianne Lind, Jette Jacobsen, René Holm og Anette Müllertz
Fra Lægemiddelforskning 2006
Lægemidler gives normalt som tabletter, fordi de fleste patienter foretrækker det. En forudsætning for at anvende tabletter er, at lægemiddelstoffet opløses i tarmvæsken og derefter passerer tarmvæggen for at komme ud i blodet, som transporterer stoffet hen til virkningsstedet i kroppen. Lægemiddelindustrien screener tusindvis af lægemiddelstofkandidater hver dag. Man undersøger stoffernes evne til at binde sig til receptorer i cellemembranen, fordi de fleste lægemiddelstoffer udøver deres virkning på den måde. Men en god effekt på de ønskede receptorer er ikke ensbetydende med, at stofferne umiddelbart egner sig at blive brugt i tabletter.
I praksis er de fleste stoffer, som binder sig til receptorerne, vandskyende, og derfor er det nødvendigt at undersøge stoffernes opløselighed og evne til at passere tarmvæggen. Det er vigtigt for industrien at have gode metoder til at teste et stort antal kandidater for at få identificeret de lovende stoffer, så der ikke bruges unødvendige ressourcer på stoffer, som må kasseres sent i udviklingsprocessen, fordi de ikke er i stand til at nå ud i blodet.
Lægemiddelstofkandidaternes evne til at passere tarmvæggen undersøges typisk ved hjælp af en model, Caco-2 cellemodellen, som repræsenterer tyndtarmen. Men ofte er det vanskeligt at teste lægemiddelstofkandidater i modellen, fordi de er meget vandskyende og derfor ikke opløses i cellemodellens vandige transportmedie, som repræsenterer tarmvæsken.
Transportmedierne er vandige væsker, som bl.a. indeholder uorganiske salte, og der er gjort mange forsøg på at udvikle nye transportmedier, som forbedrer opløseligheden af lægemiddelstofferne. Tilsætning af organiske opløsningsmidler benyttes ofte, men de er skadelige for cellerne. Derfor har vi udviklet et nyt medie, der forbedrer opløseligheden samtidig med, at det er fysiologisk relevant.
Cellemodel for tarmvæggen
Caco-2-celler stammer fra humane cancerceller fra tyktarmen, og de danner ved dyrkning på filtre et enkelt cellelag. Cellerne udtrykker en lang række enzymer og transportører, som er kendetegnende for cellerne i tyndtarmen.
Caco-2-cellemodellen bruges i stort omfang af medicinalindustrien til at forudsige lægemiddelstofkandidaters evne til at blive optaget fra tarmen ind i blodbanen.
I modellen tilføres lægemiddelstoffet til donorkammeret, som efterligner tarmsiden, og der udtages prøver fra acceptorkammeret, som efterligner blodbanen. Prøverne udtages over tid for at bestemme, hvor hurtigt stoffet passerer cellelaget.
Tarmvæskens sammensætning
I den øverste del af tyndtarmen, tolvfingertarmen, udmunder kanaler fra galdeblæren og bugspytkirtlen, og herfra tilføres tarmvæsken galdesalte og phospholipider samt enzymer, der kan nedbryde fødens fedtstoffer, proteiner og kulhydrater.
Galdesalte og phospholipider har både hydrofobe (vandskyende) og hydrofile (vandelskende) egenskaber. Det medfører, at de i vandig væske vil danne nye stabile strukturer, miceller, hvor den hydrofobe del vender indad og den hydrofile del ud mod vandet. Hydrofobe stoffer fra føden såsom fedt og nedbrydningsprodukter heraf inkorporeres i den hydrofobe del af micellerne. Hydrofobe vitaminer og lægemiddelstoffer vil på samme måde blive indbygget i miceller i tyndtarmsvæsken.
Micellerne fører de hydrofobe stoffer frem til tarmvæggen, hvorpå stofferne transporteres ind i tarmcellerne. På den måde bliver mere lægemiddelstof tilgængeligt for kroppen, end det ville være tilfældet, hvis tarmvæsken udelukkende bestod af vand og uorganiske salte.
Simulerede tarmvæsker
Tarmvæsker udtaget fra mennesker har været testet som transportmedie i Caco-2-cellemodellen for at øge den fysiologiske relevans af forsøgene, men processen med at opsamle tarmvæske er omstændelig, og der er stor variation fra individ til individ. Dette gør, at metoden ikke er særlig anvendelig til screening af mange stoffers evne til at passere tarmvæggen. Derfor er den foretrukne løsning at fremstille et medie, der efterligner tarmvæsken.
Der er udviklet medier, som indeholder galdesaltet taurocholat og phospholipidet phosphatidylcholin, til brug i Caco-2-cellemodellen, fordi disse to stoffer udskilles fra galden. Men i menneskets tarm spaltes phosphatidylcholin til lyso-phosphatidylcholin af et enzym, som Caco-2-cellerne ikke har. De to phospholipider har meget forskellige egenskaber. Blandt andet er deres balance mellem hydrofob og hydrofil forskellig, hvilket medfører, at lyso-phosphatidylcholin, i modsætning til phosphatidylcholin, selv er i stand til at danne miceller. Derfor bør den simulerede tarmvæske indeholde lyso-phosphatidylcholin frem for phosphatidylcholin.
Desværre er nogle af disse indholdsstoffer skadelige over for cellerne i høje koncentrationer, og vi har derfor udført et studie for at identificere medier, som er kompatible med Caco-2-cellemodellen. Vi har vist, at det er muligt at benytte et medie bestående af lyso-phosphatidylcholin og taurocholat.
- I tarmen befinder hydrofobe lægemiddelstoffer sig både i fri form og indbygget i miceller. Den fuldstændige mekanisme for transporten af lægemiddelstof fra micellerne og ind i tarmcellerne kendes ikke, men det er sandsynligt, at lægemiddelstoffet frigives fra micellerne og transporteres i fri form hen til tarmcellerne.
Albumin på blodsiden
Tyndtarmscellernes membraner består af hydrofobe komponenter som phospholipider og kolesterol, og derfor har hydrofobe lægemiddelstoffer større affinitet for cellemembranen end for transportmediet. Som følge heraf ophobes lægemiddelstoffet i Caco-2-cellerne og transporteres ikke ud i acceptorkammeret.
Af den grund er det svært at estimere stoffets evne til at passere tarmvæggen. I kroppen binder lægemiddelstoffet sig til proteiner i blodet, bl.a. albumin, når det har passeret tarmcellerne. Tilsætning af albumin til acceptormediet i Caco-2-cellemodellen nedsætter den ophobede mængde lægemiddelstof i cellerne, hvilket forbedrer modellens evne til at forudsige transporthastigheden over cellelaget.
Tæt på fysiologiske forhold
Vore forsøg har vist, at den nye simulerede tarmvæske fordobler opløseligheden af det hydrofobe lægemiddelstof østradiol, og brug af den simulerede tarmvæske har også på anden vis betydning for transporten af lægemiddelstoffer. Når østradiol er inkorporeret i miceller, er transporten over Caco-2-cellerne langsommere, hvilket indikerer at østradiol først skal frigives fra micellerne til transportmediet, før det kan transporteres over cellelaget.
Den simulerede tarmvæske påvirker også transportører i cellemembranen, som fungerer som en forsvarsmekanisme mod alle de kemiske stoffer, som kroppen udsættes for, ved at sende uønskede stoffer tilbage på tarmsiden igen, så de ikke transporteres ud til blodbanen. Nogle af indholdsstofferne i de simulerede tarmvæsker hæmmer disse transportører.
Anvendelse af simulerede tarmvæsker og albuminmedier i Caco-2-cellemodellen øger altså ikke blot opløseligheden af lægemiddelstoffer, men efterligner også den naturlige proces i tarmen. Brugen af disse medier kan derfor øge forståelsen af de processer, som sker i kroppen.
Som tidligere nævnt indeholder tarmvæsken også nedbrydningsprodukter fra fordøjelsen af fedt og andre næringsstoffer. Disse stoffer har en væsentlig indflydelse på miljøet i tarmen, bl.a. på micellernes størrelse og egenskaber, og dermed også på optagelsen af hydrofobe lægemiddelstoffer. Derfor vil den fortsatte forskning fokusere på at udvikle transportmedier til Caco-2-celleforsøg, som indeholder nedbrydningsprodukter fra fordøjelsen for at efterligne situationen efter et måltid.
- Transporten af et hydrofobt lægemiddelstof, østradiol, over laget af Caco-2 celler i modellen af tarmvæggen afhænger af, hvilket transportmedie, der benyttes. Tilstedeværelsen af miceller i den simulerede tarmvæske mindsker transporten af østradiol.
