Unaturlige aminosyrer skaber ny viden om proteiner
Proteiner er mål for de fleste lægemidler, og derfor er studiet af proteiner centralt for udviklingen af ny medicin. En revolutionerende teknik, hvor unaturlige byggesten indsættes i proteiner, skaber øget viden om proteiners funktioner og deres samspil med lægemidler.
Af Julie Rannes, Jacob Andersen, Leif Christensen, Anders A. Jensen og Kristian Strømgaard
Fra Lægemiddelforskning 2006
Kroppens vigtigste byggesten og arbejdsheste er proteiner, og mennesket danner tusindvis af forskellige proteiner, der udfører et væld af livsnødvendige funktioner i organismen. Men proteiner kan også være årsag til sygdomme, når de ikke fungerer korrekt. Derfor er studiet af proteiner uhyre vigtigt for at kunne forstå, hvordan en lang række sygdomme opstår, og hvordan sygdommene kan blive behandlet. Langt de fleste mål for lægemidler er netop proteiner, og proteiner kan også være lægemidler i sig selv. Et eksempel er insulin, der bruges i behandlingen af sukkersyge.
Proteiner er store biomolekyler, der er opbygget af lange kæder af aminosyrer, der folder sig sammen til en veldefineret tredimensionel struktur, som afgør proteinets funktion. Alle naturlige proteiner er opbygget af et alfabet på 20 forskellige aminosyrer. Det er vore arveanlæg, generne, som bestemmer, hvilke proteiner, der bliver dannet i en given celle. Hvert gen indeholder en kode – en opskrift - der bestemmer sammensætningen, antallet og rækkefølgen af aminosyrer i et specifikt protein.
Struktur og funktion
I dag er der opnået en omfattende viden om proteiner på et meget detaljeret niveau. Når man studerer strukturen og funktionen af disse store og komplekse biomolekyler, ønsker man ofte at undersøge betydningen af en udvalgt aminosyre i et protein, fordi en enkelt aminosyre kan have afgørende betydning for hele proteinets funktion. Ved at bruge genteknologi kan man relativt nemt udskifte en aminosyre i et protein med en af de 19 andre naturlige aminosyrer og derved få informationer om betydningen af den udvalgte aminosyre.
Alfabetet af naturlige byggeblokke er imidlertid begrænset til netop de 20 aminosyrer. Forskere har derfor længe haft et ønske om at kunne indsætte unaturlige aminosyrer i proteiner. Det vil betyde, at man kan lave vilkårlige ændringer i proteiner, uden de begrænsninger der ligger i den genetiske kode. Med unaturlige aminosyrer vil man også være i stand til at skabe drastiske såvel som meget små ændringer i proteinerne, og det kan give langt mere detaljerede informationer om betydningen af en enkelt aminosyre, end man kan opnå ved at holde sig til det naturlige alfabet.
På det seneste er der udviklet teknologier til indsættelse af unaturlige aminosyrer i proteiner, og på DFU arbejdes der med at implementere og anvende en sådan metode. Teknologien udnytter cellens eget maskineri til at fremstille de kunstige proteiner. Fremstillingen af proteiner foregår i cellens proteinfabrik, ribosomet, hvor aminosyrerne bliver sat sammen som perler på en snor. Inde i ribosomet sidder der et andet molekyle, messenger RNA (mRNA), som indeholder opskriften på det ønskede protein, dvs. hvilke aminosyrer proteinet skal bestå af, og hvilken rækkefølge aminosyrerne skal have i perlekæden.
Aminosyrer flyder rundt inde i cellen, og for at fange specifikke aminosyrer, og bringe dem til ribosomet, bruges transfer RNA (tRNA). For hver af de 20 naturlige aminosyrer findes der et tilhørende tRNA, der binder netop denne aminosyre og transporterer den til ribosomet. Hvert tRNA indeholder en kode, som er unik for den enkelte aminosyre og komplementær til koden på mRNA, og det er denne kode – den genetiske kode – der sikrer, at det rigtige protein bliver dannet.
Udvidelsen af naturens alfabet åbner nye døre for lægevidenskaben
Teknologien med at indbygge unaturlige aminosyrer i proteiner er ved at være veletableret på DFU, og metoden er et godt eksempel på kemisk biologi, hvor kemiske principper bruges i studiet af biologiske fænomener.
På DFU anvendes teknologien til at undersøge proteiner, der er mål for lægemidler, som bruges i behandlingen af Alzheimers sygdom og depression. Studierne vil skabe fundamental ny viden om disse vigtige proteiner og kan få afgørende betydning for udvikling af nye lægemidler til behandling af sygdomme i hjernen.
Andre steder bruges teknologien til udvikling af proteinbaserede lægemidler, hvor naturlige lægemidler som insulin og væksthormon modificeres ved hjælp af unaturlige aminosyrer.
Unaturlige aminosyrer
Når man ønsker at danne et protein, som indeholder en eller flere unaturlige aminosyrer, kræver det nogle essentielle justeringer af naturens eget system.
Justeringerne foretages i laboratoriet. Det er mRNA og tRNA, som skal tilpasses, så de accepterer en unaturlig aminosyre. Dertil skal man bruge et specifikt tRNA, der skal binde den unaturlige aminosyre, man ønsker at indsætte i proteinet, og transportere den hen til ribosomet. Dette tRNA skal indeholde en kode, som er forskellig fra de koder, der sørger for indsættelsen af de 20 naturlige aminosyrer, og det skal kunne binde en unaturlig aminosyre. Disse ændringer foretages i laboratoriet på naturligt forekommende tRNA.
Samtidig skal mRNA modificeres, så det genkender det modificerede tRNA og anbringer den unaturlige aminosyre netop på det rigtige sted i proteinet. Det opnås ved at indsætte en kode på det ønskede sted i mRNA, som specifikt genkender koden på det modificerede tRNA. Når de modificerede mRNA- og tRNA molekyler er fremstillet, tilsættes de til cellerne. Derpå sørger cellernes eget proteinmaskineri for at fremstille det ønskede protein med den unaturlige aminosyre. Efterfølgende kan de unaturlige proteiner evalueres ved forskellige teknikker, og på den måde kan betydningen af en enkelt aminosyre i et protein undersøges.
- Til venstre vises den naturlige proteinsyntese. mRNA, der koder for et protein, aflæses i cellens proteinfabrik, mens tRNA bringer proteinets byggesten, aminosyrerne, til fabrikken. Når komplementært mRNA og tRNA kobles sammen, sættes den rigtige aminosyre på den voksende perlekæde af aminosyrer, som proteinet består af. Til højre: I laboratoriet kobles en unaturlig aminosyre (blå) på tRNA, og mRNA modificeres, så mRNA indeholder en sekvens, der passer til tRNA med den unaturlige aminosyre. I midten: Den unaturlige aminosyre indbygges nu i proteinet.
Blødning og koagulation
Teknologien kan principielt bruges på et hvilket som helst protein, og hvilken som helst aminosyre kan indsættes. På DFU anvendes teknologien til en række forskellige projekter. Eksempelvis studeres proteinet tissue factor (TF) og dets interaktion med faktor VII. Når et blodkar brister, og en blødning starter, eksponeres vævsfaktor på indersiden af karvæggen, og her fungerer vævsfaktor som receptor for faktor VII, der binder sig til proteinet. Denne binding starter koagulationskaskaden, som får blodet til at koagulere og lukke hullet i det bristede blodkar.
Projektet udføres i samarbejde med Novo Nordisk A/S, der netop producerer og sælger faktor VII som lægemiddel til behandling af blødere. Faktor VII har desuden et stort potentiale til behandling af hjerneblødninger samt svære blødninger som følge af fx trafikulykker.
Vekselvirkningen mellem TF og faktor VII er kritisk for behandlingen af blødninger, og vi ønsker derfor at opnå et mere detaljeret kendskab til dette samspil. Specifikt studeres betydningen af en enkelt aminosyre – arginin – fordi denne aminosyres betydning og funktion er kontroversiel. I tidligere forsøg er arginin blevet erstattet med en af de naturlige aminosyrer, alanin, men alanin er meget forskellig fra arginin både med hensyn til funktionalitet og størrelse, og derfor har det været svært at udlede præcist, hvorfor arginin er så vigtig. Et studie, hvor arginin erstattes med citrullin, en unaturlig aminosyre, der i størrelse og polaritet minder om arginin, men er uladet, kan derfor bruges til at opnå en bedre forståelse af arginins betydning for proteinets aktivitet.
- Proteinet tissue factor (TF) er er afgørende for at få startet koagulationskaskaden ved blødninger, hvilket sker i et samspil med proteinet faktor VII, der anvendes medicinsk til at standse blødninger. Vekselvirkningen sker via aminosyren arginin i TF samt aminosyren aspargin (Asp 167) i den aktiverede form af faktor VII, fVIIa. Mekanismen er forsøgt opklaret ved at udskifte arginin med den naturlige aminosyre alanin, men forskellen i størrelse mellem arginin og alanin er for stor til at afklare arginins præcise betydning. Den unaturlige aminosyre citrullin har samme størrelse som arginin og giver bedre muligheder for at løse gåden.
