Uudnyttet potentiale i den mikrobielle jungle?
Bakterier skal have en utrolig tilpasningsevne for at overleve. Studier af de genetiske aspekter af bakteriers tilpasningsevne kan bruges til at forbedre de bakteriekulturer, der anvendes til produktion af protein- og peptidbaserede lægemidler.
Af Anders Fuglsang.
Fra Lægemiddelforskning 2004
Livet i den mikrobielle jungle er på ingen måde en skovtur. Er man så uheldig at være en bakterie dér, så gælder det om at være forberedt på stort set alle tænkelige lumpne tricks fra naboerne.
Hvis ikke man skynder sig at vokse og dele sig, så gør naboen det i sådan en fart, at man selv risikerer at blive kvalt. Måske udskiller naboen enzymer, der ødelægger den næring, man gerne vil bruge, hvorved ens vækst kan stoppe. Måske benytter naboen sig ligefrem af slag under bæltestedet og smider kradse kemikalier efter en i et forsøg på at komme først og blive størst. Og som om det ikke var nok, kan miljøet pludselig skifte totalt, så man på få øjeblikke skal indstille sig på at bruge en anden næring til sin funktion og vækst. Den, der ikke er tilpasset, dør!
På Institut for Farmakologi er vi for nylig begyndt at interessere os for teoretiske studier af de genetiske aspekter af bakteriers tilpasning. Til formålet anvender vi software, som vi selv udvikler. Forskningsområdet har navne som bioinformatik eller det engelske "genomics".
Siden slutningen af 1990'erne er et stort antal bakterier blevet sekventeret, hvilket vil sige, at man har kortlagt samtlige byggesten, nukleotider, i genomet, og sekvenserne er offentligt tilgængelige. Men selv om man kender alle nukleotiderne i en organisme, så er det ikke sikkert, at man ved særlig meget om betydningen af dem. Det er her, bioinformatikken kommer ind i billedet.
Anvendelse af codons
Et af de genetiske aspekter, som er et godt studie værd, er bakteriers anvendelse af codons. Codons er tripletter med tre nukleotider, som oversættes fra DNA til RNA og derfra videre til de aminosyrer, som bruges til at bygge et protein.
Der findes 20 aminosyrer og 64 codons, så de fleste aminosyrer kan dannes ud fra mere end et codon. Nogle aminosyrer dannes dog kun ud fra ét bestemt codon. Et eksempel er aminosyren tryptofan. I skarp kontrast hertil kan man nævne aminosyren leucin, som kan dannes ud fra seks forskellige codons.
Det har vist sig, at der absolut ikke er lige mange af de seks codons, uanset hvilken organisme man taler om. Dette skyldes til dels det såkaldte mutationstryk, hvor kemiske forhold i bakteriernes miljø f.eks. medfører, at aminosyrerne guanin og cytosin med tiden ændres til adenin og thymin, således at AT-rige codons generelt foretrækkes. Meget tyder imidlertid på, at der også er tale om en tilpasning til forholdene i den mikrobielle jungle.
- Den genetiske kode: Tabellen viser sammenhængen mellem codon og aminosyre; selve princippet i den genetiske kode. Forskellige codons kan kode for samme aminosyre.
Fra gen til protein
Et gen er opskriften på et protein. Når genet aktiveres, dannes der en enkeltstrenget kopi af genet, messenger-RNA (mRNA), der fungerer som en genetisk budbringer. Cellernes proteinfabrikker, ribosomerne, aflæser mRNAet og indsætter for hvert codon en korrekt aminosyre ved hjælp af transfer-RNA (tRNA), som leverer aminosyrerne til proteinfabrikken. Man siger, at tRNA er ladet, når det har en aminosyre koblet til sig, og uladet, når det har afleveret sin aminosyre til den voksende peptidkæde.
Der er et nøje afstemt forhold mellem hvilket codon, der anvendes for en aminosyre, og ekspressionsniveauet af det pågældende protein; højt udtrykte proteiner anvender ofte et snævert sæt af de 64 codons. Dette skyldes, at niveauerne af tRNA er lave for visse tRNA'er. Processen kan tænkes at forløbe langsomt, hvis den ladede tRNA ikke er umiddelbart til stede, og her er det ikke alle typer af tRNA, som findes i cellevæsken i store mængder. De smarteste bakterier i junglen har tilpasset deres codons, så lave niveauer af bestemte tRNA ikke bliver en flaskehals, der gør, at naboen vokser hurtigere.
- Translationsprocessen: Et ribosom (grønt) afl æser mRNA'et i pilens retning. mRNA, der er vist som en vandret nukleotidsekvens, indeholder opskriften på et protein. Ribosomet rekrutterer tRNA, som bringer aminosyrerne til fabrikkens samlebånd. Én bestemt aminosyre passer til hvert enkelt codon. Aminosyrerne kobles sammen en for en og ender som en kæde af aminosyrer. Herved dannes proteinet. På tegningen er codonet CUU, som koder for aminosyren leucin, netop blevet aflæst, og den tomme tRNA har forladt ribosomet. En ny tRNA med aminosyren serin skal ind og afkodes ved AGC-codonet.
Shine-Dalgarno-sekvenser
- χ2-plot for pestbakterien, Yersinia pestis. N betegner nukleotidpositionen ovenfor et startcodon. Grafen viser, at ca. 10 nukleotider efter startcodons er tilfældigheden af nukleotidernes individuelle antal meget lille, hvilket giver en skarp top på χ2- værdierne. Dette er et typisk mønster for bakterier, der benytter sig af Shine-Dalgarno-sekvenser.
En yderligere tilpasning er de såkaldte Shine-Dalgarno-sekvenser, som er små korte sekvenser på 6-7 nukleotider. De findes ca. ti nukleotider oven for et gens startcodon, og de genkendes sekvensspecifikt af ribosomerne. Jo bedre sekvensen genkendes, desto større er chancen for, at den giver anledning til at starte proteinsyntesen for det pågældende gen. Sagt på en anden måde: Shine-Dalgarno-sekvenser kan bruges til at øge udtrykkelsen af et protein.
Det er kun bakterier, der benytter sig af denne form for tilpasning, men evolutionen har ikke tilpasset alle bakterier på denne måde. Det er muligt at finde ud af, om en bakterie benytter sig af Shine-Dalgarno-sekvenser ved hjælp af en simpel analysemetode, en χ2-test, der fungerer nogenlunde, som det kendes fra Mendelsk genetik.
χ2 antager store værdier, hvis det forventede antal af forskellige nukleotider et givet sted i genomet er meget mindre end det observerede antal. Det gælder for Shine-Dalgarno-sekvenser, fordi de er sekvensspecifikke, og fordi tilfældigheden af nukleotidernes individuelle antal er meget lille. Yersinia pestis, pestbakterien, er et eksempel på en bakterie, hvor plottet giver en fint afgrænset top omkring ti nukleotider efter genernes startcodon, hvilket er en klar indikator for, at bakterien benytter sig af Shine-Dalgarno-sekvenser.
Hvad kan det bruges til?
For tiden er et væld af bakterier ved at blive sekventeret, og samtidig satses der stærkt på at udvikle lægemidler, som består af proteiner eller dele af proteiner, som kaldes peptider.
Peptider og proteiner kan ikke syntetiseres kemisk i kolber, men kan kun fremstilles ved at gensplejse mikroorganismer, så de producerer humane peptider eller proteiner. Insulin er et klassisk eksempel på et medicinsk peptid, der fremstilles på den måde, og mange peptid- eller proteinbaserede lægemidler forventes at komme på markedet inden for få år.
Imidlertid er bakteriekulturer i fermenteringstanke en dyr måde at producere medicin på, fordi oprensningen af et peptid eller et protein fra en bakteriesuppe er særdeles besværlig. Derfor søger man hele tiden at optimere produktionen.
Her kan viden om produktionsorganismens anvendelse af codons og Shine-Dalgarno-sekvenser blive særdeles værdifuld. Hvis man forsøger at udtrykke et gen, der indeholder mange codons, som translateres ved hjælp af tRNA, der kun findes i små mængder, så risikerer man, at processen forløber langsomt. Dermed bliver udbyttet ikke så stort, som det ellers kunne være.
I sådanne tilfælde kan man give den gensplejsede bakterie en grundig ansigtsløftning ved simpelt hen at udskifte de uønskede codons med foretrukne codons, hvortil der findes tRNA i store mængder. Metoden, som kaldes codonoptimering, ændrer ikke aminosyresekvensen i det udtrykte protein, men øger udelukkende produktionskapaciteten. Samtidig kan χ2-plottet give et godt praj om, hvorvidt det kan betale sig at optimere genekspressionen ved at indsætte en Shine-Dalgarno-sekvens i bakterien.
Et af målene med vores forskning inden for dette felt er netop at fremstille software, der kan bruges til at beregne, hvordan bakteriers genekspression kan forbedres ved hjælp af codonoptimering og manipulation af Shine-Dalgarno-sekvenser. Det er et skridt i retning af at kunne drage fordel af det potententiale, som de barske forhold i den mikrobielle jungle har udstyret bakterierne med.
