siRNA – fremtidens lægemidler?
Små interfererende RNA-molekyler (siRNA) kan effektivt skrue ned for udtrykkelsen af specifikke gener. siRNA har et stort terapeutisk potentiale til behandling af sygdomme, som kan kureres ved at hæmme et eller flere gener, f.eks. kræft eller AIDS. Flere store farmaceutiske udfordringer skal dog løses, inden siRNA kan blive til lægemidler.
Alle celler i planter, dyr og mennesker har et urgammelt indbygget forsvar, som opsporer og destruerer fremmed genetisk materiale. Systemet slår til, når det opdager dobbeltstrenget RNA - for dét er lig med problemer. Dobbeltstrenget RNA kan f.eks. være virus, som er ved at inficere cellen.
Fænomenet, som er relativt nyopdaget, kaldes RNA-interferens (RNAi). I 2001 blev det publiceret, at mekanismen kan aktiveres kunstigt med små, syntetiske, dobbeltstrengede RNAmolekyler (siRNA). Når man indfører siRNA i en celle, sker der en specifik hæmning af udtrykkelsen af et gen med en komplementær sekvens, f.eks. et kræftgen.
siRNA-medieret hæmning af genudtrykkelse har et stort terapeutisk potentiale. I forsøg med cellekulturer er udvalgte gener blevet hæmmet i HIV og poliovirus, og det samme er tilfældet med en række gener, som har betydning for udvikling af kræft. I eksperimenter med mus er det lykkedes at behandle leverbetændelse med siRNA. Metoden er endnu ikke afprøvet på mennesker, men forsøg med at behandle AIDS-ramte børn planlægges nu i USA.
Hvad er RNA?
RNA er en forkortelse for ribonukleinsyre. RNA er en polymerkæde, der lige som DNA er opbygget af monomerer, der kaldes nukleotider. Nukleotiderne i RNA består af sukkerstoffet ribose, en fosfatgruppe, der forbinder nukleotiderne indbyrdes, samt en base. I RNA findes baserne adenine (A), guanine (G), cytosine (C) og uracil (U). Baserne kan parre indbyrdes - G med C og A med U - og danne en dobbeltstrenget struktur.
RNA er involveret i aflæsning af information lagret i DNA og medvirker på flere fronter i proteinsyntesen.
Molekylær mekanisme bag RNAi
- Et optisk snit af HeLa-celler optaget ved konfokalmikroskopi. HeLa-cellerne er stabilt transfekteret med proteinet Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP), der er et grønt fluorescerende protein (vist ved den grønne farve). Cellerne øverst er ubehandlede. Cellerne nederst er behandlet med komplekser af kationiske liposomer og siRNA, der er mærket med en rød farve. Det ses, at behandling med siRNA fører til optagelse af siRNA i cellerne og hæmning af udtrykkelsen af EGFP (den grønne farve er knap synlig på nederste billede).
Vi har efterhånden en god forståelse af de molekylære mekanismer bag naturlig RNA-interferens: Når der er dobbeltstrenget RNA i cellevæsken, nedbryder et enzym RNA'et til små siRNA-molekyler. siRNA-molekylerne indbygges derpå i et proteinkompleks, der katalyserer en opsnoning til enkeltstrenget siRNA, som efterfølgende guider komplekset hen til budbringer-RNA (mRNA) med en komplementær sekvens. mRNA er en enkeltstrenget kopi af et gen, der indeholder opskriften på det protein, som genet koder for. Under normale omstændigheder aflæses mRNA i cellernes proteinfabrikker, som så producerer proteinet. Det forhindres imidlertid, når mRNA indfanges af proteinkomplekset, som nedbryder budbringeren. På den måde hæmmes udtrykkelsen af det pågældende gen, som f.eks. kan være et gen fra vira som HIV, der udnytter cellens maskineri til at danne sine proteiner.
En tilsvarende proces finder sted, når syntetiske siRNA-molekyler indføres i en celle, og det kan bruges til at hæmme hvilket som helst gen med en komplementær sekvens. siRNA har flere fordele sammenlignet med den beslægtede metode antisense medicin, som typisk består af korte, enkeltstrengede DNA-sekvenser, der neutraliserer mRNA fra udvalgte sygdomsgener. De største fordele er, at siRNA er effektiv i langt lavere koncentrationer, at siRNA er mere stabilt, samt at siRNA har en høj specificitet. Ændring af blot en base i siRNAet kan reducere aktiviten dramatisk. Netop den høje specificitet gør siRNA attraktivt som lægemiddel, fordi stoffet forventes at medføre langt færre bivirkninger end konventionel medicinsk behandling.
siRNA har dog også sine begrænsninger; først og fremmest er effekten relativt kortvarig. Derfor er det nødvendigt at udvikle metoder til at forlænge virkningen, hvis siRNA skal blive til lægemidler.
Vejen ind i cellen
RNA interferens finder kun sted i cellevæsken. For at bruge siRNA til sygdomsbehandling er det derfor nødvendigt, at siRNA transporteres ind gennem målcellernes membraner i tilstrækkeligt høje koncentrationer.
siRNA kan introduceres ind i pattedyrceller på to måder. Kemisk syntetiseret siRNA kan sendes direkte i cellen, eller man kan indføre DNA, som danner siRNA inde i cellen. Til det formål kan man bruge små DNA-ringe, som kaldes plasmider, eller vira. Fra et farmaceutisk synspunkt er kemisk syntetiseret siRNA at foretrække, fordi dosis nøje kan kontrolleres, og fordi man undgår en række bivirkninger og risici, der er forbundet med anvendelse af virus.
Desværre er det svært at få syntetisk siRNA ind gennem cellemembranen. RNA er vandopløselige og negativt ladede makromolekyler, der vanskeligt passerer en fedtholdig cellemembran med en negativt ladet overflade. Når det gælder cellekulturer, findes der dog en del kemiske og fysiske teknikker, som kan løse opgaven. De fysiske metoder anvender tryk, strøm eller ultralyd til at tvinge molekylerne ind i cellen. De kemiske metoder er baseret på positivt ladede molekyler som lipider eller polymerer, der kan kompleksbinde de negativt ladede RNA-molekyler i partikler. Partikler med en positiv nettoladning kan binde til cellemembranen. Derpå kan partiklerne optages via små indsnøringer af cellemembranen ved en proces, der kaldes endocytose.
siRNA-partikler skal frigives fra indsnøringerne til cellevæsken for at have en terapeutisk effekt, og det er tilsyneladende en flaskehals for den nye form for medicin. Især gælder det om at undgå sammensmeltning med organeller i cellen, der kaldes lysosomer, og som nedbryder siRNA. Problemet kan dog sandsynligvis løses ved at koble siRNA sammen med bestemte peptider eller polymerer, som i forsøg har vist en positiv effekt på frigivelsen af siRNA til cellevæsken.
- Den molekylære mekanisme bag RNA interferens: Dobbeltstrenget RNA fordøjes i cellevæsken til siRNA-molekyler af enzymet Dicer og indbygges i proteinkomplekset RNA-induced silencing complex (RISC). RISC katalyserer opsnoningen af siRNA-dupleksen til enkeltstrenget siRNA, som efterfølgende guider RISC til homologe mRNA-molekyler, der kløves og nedbrydes. Kemisk syntetiseret siRNA kan også inkorporeres i RISC og mediere RNA interferens.
siRNA i forsøgsdyr
Der er efterhånden mange eksempler på effektiv hæmning af udvalgte gener med siRNA i cellekulturer. Men de anvendte fysiske og kemiske metoder til at få siRNA ind i cellerne er dog oftest uegnede til brug i større organismer. Når det gælder dyreforsøg, er det hidtil stort set kun lykkedes at bruge virussystemer og såkaldt hydrodynamisk injektion, hvor siRNA indgives i en vene sammen med en større mængde væske.
Ved hjælp af disse teknikker er det lykkedes at inducere RNAi i mus, hvilket giver store forhåbninger til anvendelsen af siRNA i mennesker. Virale transportsystemer og hydrodynamisk injektion er dog ikke acceptable til applikation i mennesker. Hvis siRNAs store potentiale som lægemiddel skal udnyttes, er det derfor vigtigt at udvikle klinisk acceptable systemer, som effektivt og helst via blodet kan bringe siRNA hen til målcellerne og ind gennem cellemembranerne.
I biomakromolekylegruppen på Institut for Farmaci arbejder vi på at fremstille og karakterisere transportsystemer til siRNA baseret på lipider og polymerer, der kan målrette siRNA til specifikke celler og væv og sikre opnåelsen af terapeutiske koncentrationer af siRNA i cellevæsken.
Transportsystemerne afprøves både i cellekulturer og i musemodeller, hvor vi undersøger siRNA-effekten, dels på et modelgen og dels på et gen med betydning for udviklingen af leddegigt. Desuden undersøger vi frit siRNA og siRNA-transportsystemers stabilitet i biologisk relevante medier samt i mus. Undersøgelserne vil forhåbentlig kunne vise, om siRNA i fremtiden kan blive et nyt lægemiddelprincip.
Projektet er en del af en større centerbevilling fra Statens Teknisk Videnskabelige Forskningsråd, der involverer grupper på DFU, Århus Universitet og Utrecht Universitet samt firmaerne Pipeline Biotech A/S og H. Lundbeck A/S. Mere information kan findes på centrets hjemmeside: www.sirna.dk.
Hvad er siRNA?
siRNA er en forkortelse for små, interfererende RNA-molekyler, der er dobbeltstrengede RNA duplekser. siRNA-molekyler er mest potente, hvis de er 21-23 nukleotider lange, har 2-3 nukleotid 3´overhæng, 5´fosfat og 3´hydroxylgrupper.
Hent artiklen i pdf-format
